【摘要】： 目的 腎綜合征出血熱病毒(HFRSV)為布尼亞病毒科漢坦病毒(HV)屬成員。因其致病性強(qiáng)，世界衛(wèi)生組織已將其列為潛在的生物戰(zhàn)劑。其中漢灘型(HTN)與漢城型(SEO)在我國廣泛分布，引起發(fā)病率和病死率較高的腎綜合征出血熱(HFRS)，每年病例占全球總病例的90%以上。雖然近年來HFRS發(fā)病率和病死率在我國呈下降趨勢(shì)，但疫區(qū)仍在不斷擴(kuò)大，并已波及某些中心城市。因而，從分子水平積極開展HFRSV的免疫預(yù)防和治療研究具有重要意義。 材料和方法 根據(jù)鼠源抗體可變區(qū)(V)氨基酸序列，設(shè)計(jì)合成一組抗體重、輕鏈可變區(qū)(VH/VK)簡(jiǎn)并引物。采用一步法提取單克隆抗體(McAb)H7、B11和F3細(xì)胞總RNA，通過RT-PCR擴(kuò)增V基因，并進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定和分析。同時(shí)，利用McAb F3及B11，應(yīng)用噬菌體肽文庫篩選特異性的抗體結(jié)合肽，夾心ELISA和競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn)分析獲得的噬菌體短肽與篩選配基的結(jié)合能力及特異性，陽性克隆序列測(cè)定和同源性分析；在此基礎(chǔ)上，通過動(dòng)物免疫試驗(yàn)初步分析噬菌體顆�？乖拿庖咴�。 結(jié)果 通過RT-PCR成功克隆5條可變區(qū)基因，均為開放閱讀框，符合小鼠抗體框架結(jié)構(gòu)。B11-VH隸屬于JH4重排，長(zhǎng)345 bp，編碼115個(gè)氨基酸；H7-VK屬JK4重排，長(zhǎng)357 bp，編碼119個(gè)氨基酸；H7-VH屬JH4重排，長(zhǎng)360 bp，編碼120個(gè)氨基酸；F3-VK屬JK1重排，長(zhǎng)348 bp，編碼116個(gè)氨基酸；F3-VH屬JH3重排，長(zhǎng)366 bp，編碼122個(gè)氨基酸。將上述基因核苷酸序列輸入GenBank查詢，證實(shí)為新基因，登記號(hào)依次為AY245600~AY245604。同時(shí)，應(yīng)用噬菌體肽文庫篩選獲得的特異性抗體結(jié)合肽陽性率達(dá)80%以上，可特異性地與篩選抗體結(jié)合。序列分析表明，McAb F3特異性結(jié)合肽的推導(dǎo)氨基酸序列高度一致，為MHGPTKNQMWHT，與HFRSV M蛋白G2區(qū)第750~759位氨基酸有較高的同源性；而McAb B11特異性的結(jié)合肽在氨基酸水平表現(xiàn)出一定的多態(tài)性(分為4組)，推測(cè)其序列基序?yàn)?M/F)HR(H/T)X(H/W)或(R/F)HX(H/T)PWL。陽性克隆動(dòng)物免疫試驗(yàn)表明，，噬菌體肽抗原不僅具有良好的免疫反應(yīng)性，而且具有良好的免疫原性，是天然病毒抗原較好的免疫原模擬物。 結(jié)論 上述McAb可變區(qū)基因的獲得及模擬表位的初步鑒定，為有目的地開展 WP=10 HFRSV基因工程抗體的遺傳改造及體外親和力成熟等研究，以及基于表位的HFRSV多肽疫苗及DNA疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

NA；Lane 2：F3 RNA；Lane 3：H7 RNA；La圖 1-1 雜交瘤細(xì)胞總 RNA 提取Fig1-1 Total RNA of hybridoma H7、B11 and 膠電泳檢測(cè) PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果顯示 VH小一致(部分結(jié)果見圖 1-2)。其中，B11在 300~400 bp 間有三條較清晰的擴(kuò)增片善擴(kuò)增結(jié)果，因而對(duì)上述產(chǎn)物進(jìn)行分段1 2 3 4 5 6 7

RNA；Lane 2：F3 RNA；Lane 3：H7 RNA；Lan圖 1-1 雜交瘤細(xì)胞總 RNA 提取Fig1-1 Total RNA of hybridoma H7、B11 and F膠電泳檢測(cè) PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果顯示 VH大小一致(部分結(jié)果見圖 1-2)。其中，B11，在 300~400 bp 間有三條較清晰的擴(kuò)增片改善擴(kuò)增結(jié)果，因而對(duì)上述產(chǎn)物進(jìn)行分段1 2 3 4 5 6 7
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2711691