【摘要】：目的：缺血性疾病是臨床上難治性疾病，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)刺激缺血部位生長出健康有效的新生血管成為治療缺血性疾病的研究熱點(diǎn)。最近的研究表明，VEGF基因和Angiopoietin1基因在血管生成的早期和晚期階段分別發(fā)揮著重要作用。腺相關(guān)病毒基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)是一種比較有前途的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。本課題建立一個可同時表達(dá)人血管生長素1(Angiopoietin1)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的重組腺相關(guān)病毒載體基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，為下一步的研究做準(zhǔn)備工作。 方法：根據(jù)Gene Bank提供的原始序列設(shè)計(jì)引物Pang1和Pang2，以骨髓cDNA文庫為模版，利用PCR技術(shù)，獲取目的基因Angiopoietin1。根據(jù)質(zhì)粒phVEGF的原始序列設(shè)計(jì)引物Pvegf1和Pvegf2，利用PCR技術(shù)，獲取目的基因VEGF165。Angiopoietin1的上游含有HindⅢ酶切位點(diǎn)，下游含有BamHⅠ酶切位點(diǎn)，VEGF165的上游含有BglⅡ位點(diǎn)，下游含有BamHⅠ位點(diǎn)。質(zhì)粒pAAV-MCS中含有BamHⅠ、BglⅡ、HindⅢ、NotⅠ、XhoⅠ、XbaⅠ、SalⅠ、BspHⅠ、KspⅠ酶切位點(diǎn)。而質(zhì)粒pZero++中幾乎含有所有常用的酶切位點(diǎn)，利用這一特點(diǎn)，可很容易的找到與上述位點(diǎn)粘端互補(bǔ)的酶切位點(diǎn)，通過體外DNA重組技術(shù)，，將Angiopoietin1和VEGF165基因亞克隆進(jìn)入pAAV-MCS。 結(jié)果：測序證實(shí)PCR產(chǎn)物Angiopoietin1和VEGF165基因與Gene Bank提供的原始序列完全一致。酶切鑒定與測序鑒定證實(shí)重組質(zhì)粒pAAV VEGF，pAAV Angiopoietin1和pAAV Angiopoietin1-VEGF與預(yù)期結(jié)果完全一致。在新的重組質(zhì)粒中，Angiopoietin1和VEGF165各有一套CMV啟動子和poly A終止子系統(tǒng)，保證了兩種基因的共同表達(dá)。 結(jié)論：人Angiopoietin1和VEGF基因AAV共表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建成功，為嚴(yán)重缺血性疾病基因治療的研究奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號】：R346

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2705569