發(fā)布時間：2020-06-08 16:57

【摘要】：內(nèi)皮細胞的遷移是血管生成的重要啟動過程。多種血管生長因子如：內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)，肝細胞生長因子(HGF)等通過復雜的信號途徑誘導細胞的遷移。細胞內(nèi)鞘氨醇激酶(SPK)是催化鞘氨醇生成1-磷酸鞘氨醇(S1P)的限速酶。S1P是具有很強促血管生成活性的脂類分子，通過細胞內(nèi)和細胞外兩種機制參與細胞遷移的調(diào)節(jié)。細胞內(nèi)S1P可以作為第二信使參與血管生成信號的轉(zhuǎn)導。分泌到細胞外S1P與細胞膜表面的特異G蛋白偶聯(lián)受體-內(nèi)皮細胞分化基因(EDG)結(jié)合，調(diào)節(jié)或激活多種細胞遷移信號。因此，SPK是細胞遷移活動中的重要信號分子。 多種細胞因子通過不同的信號途徑激活細胞內(nèi)的SPK。HGF，又稱擴散因子(SF)具有非常強的誘導細胞遷移的作用。我們的研究證明HGF和受體c-Met相互作用可以激活內(nèi)皮細胞的SPK，但是，SPK在HGF誘導的細胞遷移中的作用并不清楚。為此，我們構(gòu)建并制備了攜帶人SPK野生型和突變體基因的重組腺病毒載體，利用腺病毒載體介導的基因轉(zhuǎn)移方法將SPK野生型基因或其突變體導入內(nèi)皮細胞，評價了SPK在HGF誘導內(nèi)皮細胞遷移中的作用。我們利用Bgl Ⅱ、NotⅠ限制性內(nèi)切酶位點將全長SPK基因(SpK~(WT))及突變體SPK基因(SPK~(G82D))克隆至Ad-Easy腺病毒系統(tǒng)的穿梭載體Pshuttle-cmv，獲得Pshuttle-cmv-SPK~(WT)及Pshuttle-cmv-SPK~(G82D)；利用內(nèi)切酶將其線性化后，轉(zhuǎn)化BJ-AD-1感受態(tài)細胞，獲得Re-ad-SPK~(WT)及Re-ad-SPK~(G82D)腺病毒重組質(zhì)粒。經(jīng)測序和酶切鑒定正確后，利用脂質(zhì)體介導的基因轉(zhuǎn)移方法，，將Re-ad-SPK~(WT)及Re-ad-SPK~(G82D)轉(zhuǎn)染293細胞，獲得重組腺病毒rAd-SPK~(WT)及rAd-SPK~(G82D)；在293細胞中分別擴增rAd-SPK~(WT)及rAd-SPK~(G82D)純化病毒；以噬斑分析法測定病毒感染梯度。獲得了攜帶SPK基因的重組腺病毒。 內(nèi)皮細胞ECV304表達HGF的受體c-Met。同時表達S1P的受體EDG，因此是研究HGF與SPK關系的理想模型。我們利用細胞擴散盒技術(shù)確定了HGF誘導ECV304細胞遷移的作用。另外，HGF和c-Met結(jié)合可以激活細胞內(nèi)SPK的活性。我們分別利用攜帶SPK野生型基因和突變體基因的重組腺病毒感染ECV304細胞。發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)野生型SPK基因過表達可明顯增強HGF誘導的內(nèi)皮細胞遷移；而表達SPK突變體基因阻斷內(nèi)源性SPK酶的活性則可以抑制HGF誘導的ECV304細胞的遷移。研究結(jié)果表明，SPK參與調(diào)控HGF／c-Met誘導的內(nèi)皮細胞遷移的信號轉(zhuǎn)導。SPK有可能作為新的靶點用于血管生成的治療。
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2004
【分類號】：R346

【共引文獻】

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1 蘆曙輝,王玉琦;細胞遷移機制的研究進展[J];中國臨床醫(yī)學;2003年06期

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3 李展宇;易先平;;FAK及FAK在心肌肥大信號傳導中的作用[J];中山大學研究生學刊(自然科學、醫(yī)學版);2006年04期

4 梁光波,金惠銘;粘著斑激酶在血管內(nèi)皮細胞遷移中的作用[J];中國病理生理雜志;2004年06期

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本文編號：2703375