【摘要】：內(nèi)皮細(xì)胞的遷移是血管生成的重要啟動過程。多種血管生長因子如：內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)，肝細(xì)胞生長因子(HGF)等通過復(fù)雜的信號途徑誘導(dǎo)細(xì)胞的遷移。細(xì)胞內(nèi)鞘氨醇激酶(SPK)是催化鞘氨醇生成1-磷酸鞘氨醇(S1P)的限速酶。S1P是具有很強(qiáng)促血管生成活性的脂類分子，通過細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外兩種機(jī)制參與細(xì)胞遷移的調(diào)節(jié)。細(xì)胞內(nèi)S1P可以作為第二信使參與血管生成信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。分泌到細(xì)胞外S1P與細(xì)胞膜表面的特異G蛋白偶聯(lián)受體-內(nèi)皮細(xì)胞分化基因(EDG)結(jié)合，調(diào)節(jié)或激活多種細(xì)胞遷移信號。因此，SPK是細(xì)胞遷移活動中的重要信號分子。 多種細(xì)胞因子通過不同的信號途徑激活細(xì)胞內(nèi)的SPK。HGF，又稱擴(kuò)散因子(SF)具有非常強(qiáng)的誘導(dǎo)細(xì)胞遷移的作用。我們的研究證明HGF和受體c-Met相互作用可以激活內(nèi)皮細(xì)胞的SPK，但是，SPK在HGF誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移中的作用并不清楚。為此，我們構(gòu)建并制備了攜帶人SPK野生型和突變體基因的重組腺病毒載體，利用腺病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移方法將SPK野生型基因或其突變體導(dǎo)入內(nèi)皮細(xì)胞，評價了SPK在HGF誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移中的作用。我們利用Bgl Ⅱ、NotⅠ限制性內(nèi)切酶位點將全長SPK基因(SpK~(WT))及突變體SPK基因(SPK~(G82D))克隆至Ad-Easy腺病毒系統(tǒng)的穿梭載體Pshuttle-cmv，獲得Pshuttle-cmv-SPK~(WT)及Pshuttle-cmv-SPK~(G82D)；利用內(nèi)切酶將其線性化后，轉(zhuǎn)化BJ-AD-1感受態(tài)細(xì)胞，獲得Re-ad-SPK~(WT)及Re-ad-SPK~(G82D)腺病毒重組質(zhì)粒。經(jīng)測序和酶切鑒定正確后，利用脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移方法，，將Re-ad-SPK~(WT)及Re-ad-SPK~(G82D)轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，獲得重組腺病毒rAd-SPK~(WT)及rAd-SPK~(G82D)；在293細(xì)胞中分別擴(kuò)增rAd-SPK~(WT)及rAd-SPK~(G82D)純化病毒；以噬斑分析法測定病毒感染梯度。獲得了攜帶SPK基因的重組腺病毒。 內(nèi)皮細(xì)胞ECV304表達(dá)HGF的受體c-Met。同時表達(dá)S1P的受體EDG，因此是研究HGF與SPK關(guān)系的理想模型。我們利用細(xì)胞擴(kuò)散盒技術(shù)確定了HGF誘導(dǎo)ECV304細(xì)胞遷移的作用。另外，HGF和c-Met結(jié)合可以激活細(xì)胞內(nèi)SPK的活性。我們分別利用攜帶SPK野生型基因和突變體基因的重組腺病毒感染ECV304細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)野生型SPK基因過表達(dá)可明顯增強(qiáng)HGF誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞遷移；而表達(dá)SPK突變體基因阻斷內(nèi)源性SPK酶的活性則可以抑制HGF誘導(dǎo)的ECV304細(xì)胞的遷移。研究結(jié)果表明，SPK參與調(diào)控HGF／c-Met誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞遷移的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。SPK有可能作為新的靶點用于血管生成的治療。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號】：R346

【共引文獻(xiàn)】

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2 金惠銘;治療性血管新生研究的若干進(jìn)展[J];國外醫(yī)學(xué)(生理、病理科學(xué)與臨床分冊);2003年04期

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2 陳柏林;益氣活血中藥對腦出血大鼠腦內(nèi)TSP-1、TSP-2及其受體CD36蛋白表達(dá)的影響[D];中南大學(xué);2008年

本文編號：2703375