【摘要】：目的 建立人巨細(xì)胞病毒(human cytomegaiovirus，HCMV)潛伏感染的老年小鼠AD樣神經(jīng)病理學(xué)模型，觀察HCMV潛伏感染引起小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)病理的改變，以期為AD(Alzheimer's disease，AD)的病因?qū)W研究及發(fā)生機(jī)制提供新的思路和合適的動(dòng)物模型。 方法 將24只8周齡SPF級(jí)BALB／c小鼠按雌、雄1：1配成12對(duì)，并隨機(jī)分成病毒感染組和DMEM對(duì)照組，每組6對(duì)。病毒感染組每只小鼠腹腔注射HCMV懸液1×10~5PFU／ml 1.0 ml：DMEM對(duì)照組小鼠每只腹腔注射DMEM液1.0 ml。以上兩組在屏蔽系統(tǒng)中繼續(xù)飼養(yǎng)十四個(gè)月后，將一半小鼠引頸處死，，取大腦組織進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)以確定HCMV的潛伏感染：(1)勻漿進(jìn)行病毒分離及體外激活實(shí)驗(yàn)；(2)PCR、RT-PCR分別檢測(cè)HCMV UL83 DNA、IE DNA和相應(yīng)的mRNA；(3)石蠟包埋切片用于原位雜交和免疫熒光，分別檢測(cè)HCMV UL83 DNA、IE DNA和HCMV pp65抗原的表達(dá)；(4)戊二醛固定，超薄切片用透射電鏡觀察大腦皮層神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)變化和皰疹樣病毒顆粒。在確定的HCMV潛伏感染小鼠腦組織的基礎(chǔ)上，通過如下實(shí)驗(yàn)觀察HCMV潛伏感染引起小鼠大腦皮質(zhì)的AD樣的病理改變：(1)HE染色觀察大腦皮質(zhì)神經(jīng)病理學(xué)改變；(2)剛果紅染色觀察淀粉樣斑塊；(3)浸銀染色觀察神經(jīng)元纖維纏結(jié)并計(jì)數(shù)單位面積中神經(jīng)元和神經(jīng)元纖維纏結(jié)的數(shù)目；(4)免疫熒光檢測(cè)Tau蛋白的表達(dá)；(5)透射電鏡照片計(jì)數(shù)突觸數(shù)密度。同時(shí)對(duì)剩下的另一半小鼠進(jìn)行免疫抑制干預(yù)，誘導(dǎo)HCMV的體內(nèi)再激活，以進(jìn)一步確定HCMV的潛伏 安徽醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文 感染。按15Omg/kg的劑量給各組小鼠腹腔注射環(huán)磷酞胺，每隔六天注射一次，如此 共注射三次，在最后一次注射后的第六天處死所有小鼠，取小鼠大腦皮質(zhì)戊二醛固 定，透射電鏡觀察疤疹樣病毒顆粒。 結(jié)果(l)病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果:①病毒感染組實(shí)驗(yàn)結(jié)果:勻漿病毒分離為陰性，但經(jīng) 體外激活后可見到典型的HCMV致CPE;可擴(kuò)增出HCMV UL83和IE DNA且序列 測(cè)定結(jié)果與Genbank上登錄的基因序列比較相一致;RT一PCR未見特異性的條帶;原 位雜交試驗(yàn)進(jìn)一步證明HCMV DNA存在于大腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞的胞漿內(nèi):免疫熒 光未檢測(cè)到pp65抗原的表達(dá);透射電鏡觀察可見小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元核內(nèi)出現(xiàn)絲狀 包涵體，未找到疙疹樣病毒顆粒，但經(jīng)體內(nèi)激活后，病毒感染組小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng) 元胞漿內(nèi)及血管內(nèi)皮細(xì)胞中均觀察到典型的疙疹樣病毒顆粒。②以上結(jié)果對(duì)照組均 為陰性。(2)病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果:HE染色發(fā)現(xiàn)感染組小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元數(shù)量減 少，出現(xiàn)紅色斑塊及神經(jīng)元纖維纏結(jié)，但對(duì)照組未發(fā)現(xiàn)明顯的病理改變;剛果紅染 色從感染組小鼠大腦皮質(zhì)觀察到淀粉樣斑塊;浸銀染色從感染組小鼠大腦皮質(zhì)可同 時(shí)觀察到淀粉樣斑塊和神經(jīng)元纖維纏結(jié)，對(duì)照組小鼠大腦皮質(zhì)也發(fā)現(xiàn)個(gè)別的神經(jīng)元 纖維纏結(jié)。同對(duì)照組相比，感染組小鼠大腦皮質(zhì)tan蛋白沉積團(tuán)塊分布密集，神經(jīng)元 纖維纏結(jié)數(shù)目顯著升高，突觸數(shù)密度和單位面積中的神經(jīng)元數(shù)目則顯著降低 (P0 .01)。 結(jié)論1.首次建立 HCMV潛伏感染老齡小鼠模型，為闡明HCMV在腦組織的潛伏感 染機(jī)制奠定了重要基礎(chǔ)。 2.首次發(fā)現(xiàn)HCMV感染老齡小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元內(nèi)呈較規(guī)則折疊的絲狀包涵體，為 研究老年小鼠神經(jīng)元結(jié)構(gòu)與功能間關(guān)系提供新線索。 3.首次建立HCMV潛伏感染老年小鼠AD樣神經(jīng)病理學(xué)模型，為人類探索研究AD 病提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號(hào)】：R-332

【參考文獻(xiàn)】

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1 張琳,買鴻宴,黃浩,劉賀飛,南燕,尚俊杰,廖洪恩,于恩華,沈麗;突觸數(shù)密度Disector測(cè)量法的建立與計(jì)算機(jī)輔助分析的實(shí)現(xiàn)[J];解剖學(xué)報(bào);2000年01期

本文編號(hào)：2701567