【摘要】：目的 腺病毒AdEasy系統(tǒng)是一種利用原核細(xì)胞完成重組穿梭質(zhì)粒與腺病毒骨架質(zhì)粒之間的同源重組，快速構(gòu)建重組腺病毒的好方法。我們將其中的某些步驟進(jìn)行了改進(jìn)，以獲得一種更加高效、簡(jiǎn)便、快速構(gòu)建重組腺病毒的方法。 方法 我們將腺病毒骨架載體pAdEasy-1通過電穿孔法轉(zhuǎn)化E．coli BJ5183感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)抗性篩選、酶切鑒定獲得含pAdEasy-1的E．coli BJ5183／p菌種，并鑒定其穩(wěn)定性。隨后用CaCl_2法制備E．coli BJ5183／p感受態(tài)細(xì)胞。并轉(zhuǎn)化含GFP的腺病毒穿梭質(zhì)粒，利用E．coli BJ5183細(xì)胞內(nèi)同源重組機(jī)制獲得重組腺病毒質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定并確定重組的位置。與常規(guī)的共轉(zhuǎn)化方法相比較，了解這種方法的重組效率。將鑒定正確的重組腺病毒質(zhì)粒進(jìn)一步轉(zhuǎn)化E．coli DH10B感受態(tài)細(xì)胞，獲得高拷貝的重組質(zhì)粒。以Pac Ⅰ酶切，，獲得重組腺病毒DNA分子，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，產(chǎn)生基因組結(jié)構(gòu)均一的重組腺病毒。感染原代血吸蟲細(xì)胞進(jìn)行腺病毒嗜性的初步研究。 結(jié)果 利用改進(jìn)的方法，獲得了具有高度穩(wěn)定性可重復(fù)使用的E．coli BJ5183／p菌種，經(jīng)CaCl_2法制備為感受態(tài)細(xì)胞后，可方便地用于轉(zhuǎn)化重組穿梭質(zhì)粒，并獲得重組腺病毒質(zhì)粒。與常規(guī)方法相比較，該法的重組效率有一定的提高。重組腺病毒質(zhì)粒DNA分子轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，可觀察到293細(xì)胞出現(xiàn)腫脹，圓縮等典型的細(xì)胞病 安徽醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文 變(C PE)，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)有大量綠色熒光。進(jìn)一步感染原代血吸蟲細(xì)胞， 表明腺病毒對(duì)其有一定的嗜性。 結(jié)論改進(jìn)后的方法構(gòu)建重組腺病毒更加簡(jiǎn)便，重組效率較原方法提高，可在國(guó)內(nèi) 普通的分子生物學(xué)和病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成構(gòu)建工作。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號(hào)】：R346

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前6條

1 王俊偉;;腺病毒載體在基因治療中的應(yīng)用進(jìn)展[J];科技信息;2011年20期

2 范凌云;謝慶軍;;腺病毒載體的研究進(jìn)展[J];中國(guó)生物制品學(xué)雜志;2008年02期

3 鞠全榮;張孝衛(wèi);黃麗華;杜德田;耿秀蘭;馬力;任東俊;;IL-12基因重組腺病毒對(duì)不同腫瘤的抗瘤作用比較[J];現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué);2007年05期

4 吳立華,刁世勇,蔡英林,顧潔,任倩,李彬,楊仁池,韓忠朝;抗腫瘤的PF4及相關(guān)肽基因重組腺病毒的構(gòu)建[J];中國(guó)腫瘤臨床;2003年08期

5 鞠全榮;黃麗華;張孝衛(wèi);杜德田;耿秀蘭;劉宗印;馬力;張如勝;任東俊;;白介素12重組腺病毒載體的構(gòu)建及其抗腫瘤作用初步觀察[J];中國(guó)腫瘤;2006年09期

6 趙峰;快速構(gòu)建腺病毒載體的新方法[J];中國(guó)腫瘤生物治療雜志;2001年04期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前3條

1 王公明;N-甲基-D天冬氨酸受體2B亞基鎮(zhèn)痛疫苗的構(gòu)建及其鎮(zhèn)痛效應(yīng)的研究[D];華中科技大學(xué);2007年

2 陳漉;特異性抗腫瘤重組腺病毒抑癌作用研究[D];吉林大學(xué);2009年

3 王晶;經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路在椎間盤退變中的作用及機(jī)制研究[D];華中科技大學(xué);2009年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前4條

1 伍飛馬;PC-1特異性區(qū)段分析與功能研究及紅麻油脂CLA抗癌功能初步探討[D];福建農(nóng)林大學(xué);2011年

2 范凌云;高效分泌表達(dá)內(nèi)皮抑素的腺病毒載體研究[D];上海交通大學(xué);2009年

3 湯福祥;應(yīng)用改進(jìn)的AdEasy系統(tǒng)制備KDR啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下的雙自殺基因重組腺病毒[D];中國(guó)人民解放軍第一軍醫(yī)大學(xué);2003年

4 王俊偉;共表達(dá)TCRα12-2和TCRVβ7.1重組腺病毒載體的構(gòu)建及其殺傷肝癌細(xì)胞作用的研究[D];廣東藥學(xué)院;2008年

本文編號(hào)：2701156