【摘要】： 血吸蟲病流行于76個國家和地區(qū)，目前估計有6億人口受威脅，感染人口約2億。血吸蟲感染者中約有1.2億出現(xiàn)癥狀，其中2千萬人有疾病的嚴(yán)重后果，每年估計至少有2萬人死于血吸蟲病。截至2001年底，中國尚有12個省的418個血吸蟲病流行縣，流行區(qū)總?cè)丝诩s99萬。 盡管使用了化療及殺滅釘螺的方法，血吸蟲病的控制仍然受到以下因素的阻礙：治療方法(包括藥物毒性、行政管理、血吸蟲抗藥性等)的限制；頻繁的重復(fù)感染；疫苗研制的前景不容樂觀；缺少對血吸蟲許多生物學(xué)知識的了解。因而在這個血吸蟲病防治研究的瓶頸期，大規(guī)模地從基因水平了解血吸蟲基本的生物學(xué)、生理學(xué)，為新的治療藥物的研制及疫苗的研究提供基礎(chǔ)知識和參考數(shù)據(jù)，具有重大的意義。 在前期的研究中我們在國內(nèi)外首次構(gòu)建了日本血吸蟲尾蚴cDNA文庫，并用EST策略從文庫中篩選到一個包含完整開放讀碼框的cDNA序列，與曼氏血吸蟲8kDa鈣結(jié)合蛋白(Calcium-binding protein,CBP)基因序列同源性達(dá)82％，所編碼的蛋白具有2個EF-手的典型的鈣結(jié)合蛋白保守結(jié)構(gòu)域。本研究以所篩到的噬菌粒為模板，利用合成的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物(Sj8CaBP基因)片段長度為236bp。回收純化后連接入pMD18-T載體并亞克隆入原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)。重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入BL21細(xì)胞，構(gòu)建表達(dá)工種菌，并用IPTG誘導(dǎo)工種菌的表達(dá)。超聲裂菌，離心后收取上清中的可溶性蛋白。SDS-PAGE分析表達(dá)上清液中的蛋白。同時做參照的菌株有BL21空白對照菌及pET32a(+)轉(zhuǎn)化的BL21菌。結(jié)果可見特異性的表達(dá)條帶，pET32a(+)質(zhì)粒上的擔(dān)體蛋白、Sj8CaBP融合蛋白的分子量分別約為21kDa和29kDa。 重組蛋白用Ni-NTA樹脂純化后用SDS-PAGE進(jìn)行分析，Sj8CaBP融合蛋白的純度可達(dá)90％以上。 Western-blot的結(jié)果顯示，Sj8CaBP融合蛋白可與小鼠抗6-His抗體反應(yīng)，顯示單一的反應(yīng)帶，但它與日本血吸蟲感染兔血清及紫外照射致弱尾蚴感染兔血清都沒有特異性的反應(yīng)帶出現(xiàn)。 EUSA檢測的結(jié)果顯示，SEA檢測的效果證明所用的陰性及陽性血清 具備檢測性能。純化后的sj SCaBP融合蛋白與感染兔血清沒有免疫反應(yīng)性。 這個結(jié)果與Weste。一blot的結(jié)果是一致的。這可能是由于sj8CaBP基因是 日本血吸蟲尾黝的期特異性基因，在尾坳侵入宿主體內(nèi)24h后就不表達(dá)，而 且該蛋白的半衰期很短，導(dǎo)致該蛋白在宿主體內(nèi)存在的時間很短，，激起宿 主的免疫反應(yīng)性檢測不到. 本研究在己發(fā)現(xiàn)的新基因基礎(chǔ)上，對該基因進(jìn)行克隆、表達(dá)及蛋白的 純化，并對重組表達(dá)蛋白的免疫反應(yīng)性進(jìn)行了評價。從結(jié)果來看，該蛋白 不可能發(fā)展為一種診斷抗原，但在疫苗的潛力上，我們的實驗結(jié)果還不能 說明該蛋白不具有發(fā)展為疫苗的可能性。我們已得到日本血吸蟲新基因 skDa鈣結(jié)合蛋白的重組表達(dá)蛋白，為下一步上動物實驗，對其免疫保護(hù)性 進(jìn)行研究做好了準(zhǔn)備。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍第一軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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1 彭鴻娟,陳曉光,支國舟,王s閼

本文編號：2697124