【摘要】： 腫瘤的血管新生(angiogenesis)在腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移中起著重要的作用。血管新生是一個(gè)復(fù)雜的多步驟的過程，包括血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖(proliferation)、血管內(nèi)皮細(xì)胞的趨化(chemotaxis)、血管內(nèi)皮細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)中管樣結(jié)構(gòu)的生成 (tubular morphogenesis)。研究證明阻斷血管新生過程的一個(gè)或多個(gè)步驟，就有可能達(dá)到抑制血管生成的目的。通過抑制腫瘤內(nèi)的血管新生，就可以抑制腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移。由于這種治療方案的靶目標(biāo)定位在藥物能夠直接到達(dá)的血管內(nèi)皮細(xì)胞上，所以藥物用量較小，因此副作用也小。而且內(nèi)皮細(xì)胞的基因較腫瘤細(xì)胞要穩(wěn)定，不易產(chǎn)生耐藥性。所以通過抗血管新生來治療腫瘤是一個(gè)很有前途的治療策略，它避免了傳統(tǒng)化療方案所導(dǎo)致的毒副作用大和腫瘤易耐藥的問題，已經(jīng)成為腫瘤治療的新的研究熱點(diǎn)。 五十年代有細(xì)胞毒性的化療藥物被提出用于治療腫瘤。本著盡可能多地殺死腫瘤細(xì)胞的原則，臨床上用最大耐受劑量(MTD，Maximum Tolerance Dose)來治療病人。然而幾十年的臨床實(shí)踐證明由于化療藥物的毒副作用和腫瘤耐藥的產(chǎn)生，這種旨在殺傷腫瘤細(xì)胞的治療方案并沒有達(dá)到人們預(yù)期的目的。最近研究發(fā)現(xiàn)長春花堿、環(huán)磷酰胺、博來霉素等一些傳統(tǒng)的化療藥物在改變了治療方案后有抑制血管新生的作用。實(shí)驗(yàn)證明傳 浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文 統(tǒng)化廳藥物的抗血管新生方案能提高治療腫瘤的效力。但這些藥物的作用機(jī)理還不是恨 清楚。本實(shí)驗(yàn)通過觀察不同濃度的長春花堿對血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、血管內(nèi)皮細(xì)胞的趨 化、血管內(nèi)皮細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)中管樣結(jié)構(gòu)生成的作用，以此探索氏春花堿抑制血管新 主的機(jī)理和合適的治療劑量，為制定更完備的腫瘤治療策略提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)方法： l 低濃度的長春花堿對血管內(nèi)皮細(xì)胞增值的作用 主長良好的 ECV－304稀釋成密度為 IX 10‘／ml的細(xì)胞懸液，以每孔 200微升的量加 入96孔培養(yǎng)扳中，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱溫育24小時(shí)后分組處理。實(shí)驗(yàn)共分5組，每組共6 個(gè)復(fù)孔。未加藥組：正對照組：加藥組：氏春花堿的濃度分別為of微克／升、2．5微克 升、5微克／升、10微克／升。將 96孔培養(yǎng)扳放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)溫育 48小時(shí)。48小時(shí)后每 孔加／＼5毫克’毫升的NITT20微升，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱作用4小時(shí)后去上渭液，每孔加D卜ISO （二甲基亞礬）150微升，振蕩10分鐘，酶際儀490urn處讀數(shù)。數(shù)據(jù)處理。 二．低濃度的長春花堿對ECV－304趨化的影晌 生氏良好的 ECV－304用濃度分別為 0月微克／升、2、5 微克／升、5微克／升、10微克． 升的長春花堿處理24小時(shí)。Bo｝den ／J’至的下室加入條件培養(yǎng)基，蓋上覆有Matrteel（人 工基匣膜）的硝酸纖維濾膜，上室帕入經(jīng)不同濃度的長春花堿處理過和未經(jīng)藥物處理的紙 胞懸液 400微升。將裝配好的 Bo｝den小室放入細(xì)胞培養(yǎng)箱。溫育 IZ小時(shí)后將硝酸纖維 濾膜嘆出，去除膜上面的細(xì)胞，然后將膜固定、染色、計(jì)數(shù)穿過膜的細(xì)胞數(shù)。 3 低濃度的長春花堿對血管內(nèi)皮細(xì)胞在Matrigel（人工基底膜）中管樣結(jié)構(gòu)生成的影響 濃度為 17g／L MatFbeel以每孔 250微升的量加入 24孔培養(yǎng)扳中，放入 37oC細(xì)胞培養(yǎng) 箱聚合30分鐘。生長良好的ECV．304稀釋成密度為IX 10’／ml的細(xì)胞懸液，以每孔1M 的量加入底部己鋪有Matrigel的24孔培養(yǎng)扳中。實(shí)驗(yàn)分5組，每組共4個(gè)復(fù)孔：未加藥 組即正對照組：加藥組：長春花堿的濃度分別為：0．lffi克／升、工5微克／升、5微克／升、 ．2－ 浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文 川微分升。隨即將 24孔培養(yǎng)扳放入細(xì)胞培養(yǎng)箱溫育 8小時(shí)。然后將 24孔培養(yǎng)飯拿出在 倒宜顯微鏡下觀察ECV－304管樣結(jié)構(gòu)生成的情況。 結(jié)果： 1 長春花堿抑制ECV－304增殖的敏感濃度范圍 低濃度的長春花堿對EC＼／。304增值有影響，陋長春花堿的濃度的增加，其抑制 EC＼’．304增殖的作用增加，呈劑量依賴關(guān)系。長春花堿抑為 ECV－304增值的敏’孿濃度在 01 tA克’升到IO微克／升之間。莊這個(gè)范圍內(nèi)隨著長春花堿i農(nóng)度的增加，，抑制＊CV刁N 增值的幅度增加較明顯。當(dāng)長春花堿的濃度低于of 微克／升時(shí)，抑制作用不明顯。當(dāng)K 春花堿的濃度達(dá)到10微克／升以后，其抑制增殖的作用不再明顯增加，曲線趨向平緩。 2 不同濃度的長春花堿對ECV－304增殖的抑制率 濃度為of微克／升、25微克升、5微克／升、川微克．’升的長春花堿對ECV扣4增值 的抑制軍分別為 9．8％、453 k、60．8 ？6、72．6 ％。各用藥組與正對照組比較均有顯著性差 異（prt001）。 3 長春花堿對ECV－304的細(xì)胞毒作用 當(dāng)長春花堿的濃度逐漸增加時(shí)，長春花堿對細(xì)胞的毒性作用也越來越明顯，當(dāng)濃度 達(dá)到10 rid克科后，可清楚地看到藥物對細(xì)胞的毒性作用：細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞與細(xì) 胞之間的連接消失，細(xì)胞由正常的梭形變成圓形，細(xì)胞腫脹，細(xì)胞的折光性增加，還可 以見到明顯的細(xì)胞碎片，大小不
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2002
【分類號(hào)】：R363

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本文編號(hào)：2694701