【摘要】： 目的 維甲酸類對(duì)于體內(nèi)的各種生理過程起著重要的作用，在體內(nèi)的合成過程中需要許多酶的參與。其中輔酶Ⅱ-依賴性視黃醇脫氫／還原酶(NADP(H)-dependent retinol dehydrogenase／reducrase，NRDR)是黃東陽等于1997年從兔肝中發(fā)現(xiàn)并純化的一種新的催化視黃醇脫氫／還原的酶，參與維甲酸合成的第一步反應(yīng)。NRDR活性遠(yuǎn)大于迄今所報(bào)道的胞液的乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase，，ADH)和微粒體內(nèi)的短鏈脫氫／還原酶(short-chain dehydrogenase／reductase，SDR)類�，F(xiàn)人、小鼠、兔NRDR cDNA已被克隆并在GenBank登錄(登錄號(hào)分別為[AB045131][AB045132][AB045133])，但尚無相關(guān)的論文發(fā)表。本研究根據(jù)已知的人、小鼠、兔的NRDR基因保守序列，設(shè)計(jì)合成特異引物，應(yīng)用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(rapidly amplify cDNA ends，RACE)法，成功地克隆了牛的NRDR基因并在GenBank登錄(登錄號(hào)為AF487454)，并對(duì)該基因序列進(jìn)行了分析。為進(jìn)一步研究NRDR酶蛋白的功能及維甲酸的合成奠定了基礎(chǔ)。 方法和結(jié)果 1．總RNA的提取和cDNA文庫的獲得 用TriZOI試劑提取總RNA，獲總RNA約為100Og，RNA純度 采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD值，OD260億80值為二．84－2刀。逆 轉(zhuǎn)錄使用TaKaRa的 Reverse TranscriPtase XL（AMV）試劑盒，以 OligO dT為引物獲得CDNA文庫。 2．gi物合成及NRDR cDNA部分片段的擴(kuò)增 采用Jellyfish軟件，根據(jù)人J鼠及兔NRDR保守序列的一致 性，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，PCR擴(kuò)增得到部分CDNA序列，經(jīng)測(cè)序得到 294hP的部分片段。 3．RACE法克隆 3．13”RACE法克隆 根據(jù)TaKaRa公司（大連廣”RACE試劑盒中的說明進(jìn)行操 作。以已獲得的 294hp的部分 NRDR片段為模板，設(shè)計(jì) F引物J 引物為3”RACE試劑盒中提供的 3”site AdaPer umer，PCR擴(kuò) 增經(jīng)測(cè)序得到1200hp片段。 3．2 5”RACE法克隆 根據(jù)TaKaRa公司（大連廣”RACE試劑盒中的說明進(jìn)行操 作。以已獲得的294hP的部分NRDR片段為模板，設(shè)計(jì)5”磷酸 化RT引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，獲取單鏈CDNA完成第一步反應(yīng)；再降解 雜環(huán) RNA；接著進(jìn)行連接反應(yīng)一形成單鏈環(huán)狀 CDNA或串聯(lián)體。 設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，最后進(jìn)行巢式PCR反應(yīng)，擴(kuò)增結(jié)果得到400hp和 200hp的片段，經(jīng)測(cè)序鑒定200hp為所需的片段。 4．牛肝的NRDR基因全長(zhǎng)CDNA的確定及序列分析 將重組與PGEM－T載體的5”－Nested RACE產(chǎn)物200hp 和 3”RACE產(chǎn)物 1200hp進(jìn)行雙向測(cè)序，拼接一條 1266hp的全 長(zhǎng) cDNA序列。利用 NCBI提供的開放閱讀框架kPen reading rme，ORF）進(jìn)行開放閱讀框架的判定，從第24到806堿基為完整 的閱讀框，全長(zhǎng)為783、堿基序列，編碼260個(gè)氨基酸。確認(rèn)編碼區(qū) 的起始密碼子位于24hP，終止密碼子位于806hP；5”端的非翻譯 ·2· 區(qū)為二一23 hP；3”端的非翻譯區(qū)為807－1266hP；多聚腺昔酸 （oyA）信號(hào) aaaaa是在 1232－1237hP。其 cDNA序列通過 BLAST服務(wù)器進(jìn)行查詢與人J鼠、兔、大鼠和豬的CDNA序列顯 示出80％以上的一致性，證明此基因?yàn)榕５腘RDR CDNA序列。 GenBank數(shù)據(jù)庫查詢結(jié)果證實(shí)為一個(gè)新基因（GenBank登錄號(hào)為 AF487454）。 5。蛋白質(zhì)的功能位點(diǎn)分析 牛肝 NmR基因編碼 260個(gè)氨基酸，其等電點(diǎn)為 8．6，分子量 為27．3 kDa。其氨基酸序列與人＊鼠、兔、大鼠和豬的氨基酸序 列比較顯示有 75％以上的一致性。用 PROSITE數(shù)據(jù)庫分析牛肝 NRDR的功能位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)含有天冬氨酸N一端糖基化位點(diǎn)、蛋白激 酶Chrotein kinase C，PKC）磷酸化位點(diǎn)、酪蛋白激酶11（Casein hi－ nase 11，CKZ）磷酸化位點(diǎn)、短鏈脫氫／還原酶矚DR）家族標(biāo)記及在 C一末端有過氧化氫酶體的 C一末端靶向信號(hào)（perokisomal targe－ ting signal，PfSI）序列 SHL。 6．結(jié)構(gòu)功能域確定 用SMART軟件服務(wù)器分析牛的NRDR蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能域， 發(fā)現(xiàn)在13－256含有一個(gè)典型的adh－shorthha00106）結(jié)構(gòu) 域。 7．蛋白質(zhì)序列多重對(duì)齊分析 用＊）軟件進(jìn)行NRDR蛋白質(zhì)序列的多重對(duì)齊。結(jié)果 發(fā)現(xiàn)，牛 NRDR的氨基酸含有 SDR家族兩個(gè)保守的模序 （TAXXXGXG）與（YXXSK）。 8．牛NRDR基因組織表達(dá)圖譜分析 Tizol試劑提取各組織總RNA，在編碼區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)一對(duì)引物進(jìn) 行RT－PCR反應(yīng)，結(jié)果顯示該基因在肝、腎、心、肺、胃、腸組織有 表達(dá)。 ·3· 討 論 NRDR是參與維甲酸合成的第一步反應(yīng)的酶。推導(dǎo)的NRDR 氨基酸含有 SDR兩個(gè)保守模序和 SDR家族結(jié)構(gòu)域及 SDR家族標(biāo) 記，牛的 NRDR屬于 SDR家族的新成員。并在其氨基酸的 C一末 端含有PISI，推導(dǎo)此NRDR存在過氧化物酶體內(nèi)。但當(dāng)初NRDR 是黃東陽等從兔肝的胞液里純化的，所以對(duì)于NRDR是否存在過 氧化物酶體內(nèi)還有待于進(jìn)一步證實(shí)。如NRDR確實(shí)存在過氧化 物酶體內(nèi)，視黃醛就需從過氧化物酶體內(nèi)進(jìn)人胞液合成維甲酸，這 種運(yùn)輸對(duì)于維甲酸合成的傳統(tǒng)通路還應(yīng)是一個(gè)補(bǔ)充。這也是過氧 化物酶體內(nèi)
【圖文】：

圖55‘一NestedRACEZ加飾產(chǎn)物竹和S腸引物雙向測(cè)序結(jié)果Fig.5幾e200如sequence湘ultofs’:Nested以CE腳記uet初th竹助ds巧promoterp過mer·21·

圖63口RACE12加如產(chǎn)物竹和S托引物雙向側(cè)序結(jié)果Fig·6仆e12加如脫q，enceresultof3‘RACEp耐uct就th竹助ds托pro口IOterprimer·22·
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號(hào)】：Q785

【參考文獻(xiàn)】

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1 邢桂春,張成崗,魏漢東,賀福初;采用RACE技術(shù)獲得全長(zhǎng)人新基因MAGE-D1[J];中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào);2001年02期

本文編號(hào)：2676979