【摘要】：乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染仍舊是世界范圍內(nèi)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。目前，臨床上治療乙型肝炎的藥物主要包括α-干擾素(interferon-α，IFN-α)以及核苷類似物類藥物拉米呋啶(1amivudine)和阿地福韋(adefovir dipivoxil)。但現(xiàn)有的治療方法在大部分患者中均不能完全清除體內(nèi)的HBV。近年來，基因治療的研究取得了令人矚目的成就，這也為乙型肝炎的治療開辟了新的途徑。 乙型肝炎病毒核心蛋白和人嗜酸性粒細(xì)胞來源神經(jīng)毒素融合蛋白基因，或稱為乙型肝炎病毒靶向核糖核酸酶基因(HBV targeted ribonuclease gene，以下簡稱HBV-TR基因)是我室劉軍博士等根據(jù)核衣殼導(dǎo)向的病毒滅活原理(capsid-targeted viral inactivation，CTVI)構(gòu)建的融合基因。該基因所表達(dá)的融合蛋白由兩部分構(gòu)成：靶向分子為乙型肝炎病毒核心蛋白(HBV core protein，HBc)，，是HBV包裝過程中必需的成分；效應(yīng)分子為人嗜酸性粒細(xì)胞來源神經(jīng)毒素(human eosinophil derired neurotoxin，hEDN)，是一種核糖核酸酶。HBV-TR基因在體外實驗中可有效地抑制HBV的復(fù)制。 為進(jìn)一步研究HBV-TR基因在體內(nèi)的表達(dá)，以及為該基因在乙型肝炎小動物模型體內(nèi)的抗病毒功能研究和臨床應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)，本課題首先構(gòu)建了HBV-TR重組腺病毒載體，在HEK293細(xì)胞中大量擴增至一定滴度后感染正常小鼠，然后用免疫組織化學(xué)的方法研究該重組腺病毒在正常小鼠體內(nèi)，特別是肝臟的表達(dá)狀況及其毒性反應(yīng)。 第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文 本研究使用AdMax KitD系統(tǒng)完成HBV一TR重組腺病毒載體的構(gòu)建。 首先是構(gòu)建穿梭質(zhì)粒(Shuttle plasmid)，免mHI和從ndlll雙酶切 pcDNA3.1卜)/TR得到TR基因片段，同時用兔Hl和從ndlll雙酶切質(zhì)粒載 體pDC3 16，然后用T4 DNA連接酶將TR基因片段插入質(zhì)粒載體pOC316， 從而得到穿梭質(zhì)粒pDC316/TR。使用相同的方法構(gòu)建對照組穿梭質(zhì)粒 pDC3 16/TRm、pDC3 16/hEDN和pDC316/HBe。 分別提取穿梭質(zhì)粒pDC316/TR、pDC316/TRm、pDC316/hEDN、 pDC316/HBe、pDC316空載體和輔助質(zhì)粒(reseue plasmid) pBHGI。x么El，3cre。所有質(zhì)粒經(jīng)酚一氯仿抽提和乙醇沉淀后重新溶解于適 量的。，1 xTE(pHS.0)中以使其濃度在40 ug/mL左右。然后將各穿梭質(zhì)粒 分別和輔助質(zhì)粒以磷酸鈣法共轉(zhuǎn)染HEK 293細(xì)胞，待大部分細(xì)胞出現(xiàn)典型 的細(xì)胞病變(cyt叩athiC effect，C尸E)時，低速離心收集細(xì)胞并重懸于 PBS中，一70℃/37℃反復(fù)凍融、振蕩，最后離心收集病毒上清于一70℃保 存. 以從轉(zhuǎn)染后獲得的重組腺病毒粗提液中提取的基因組DNA為模 板，PCR分別擴增出預(yù)期的目的基因片段，從而證明HBV一TR重組腺病毒載 體(AdTR)及其對照載體AdTRm、AdhEDN和AdHBC均構(gòu)建成功。 將AdTR及其對照載體AdhEDN分別在HEK 293細(xì)胞中大量擴增至 10’‘，pfu/mL，然后用此高滴度的重組腺病毒顆粒以尾靜脈注射法分別感染 正常小鼠，給藥方法為每天1次，連續(xù)3天，而正常對照組小鼠僅注射生 理盆水。其間，定期觀察小鼠的生存狀況。于第四天處死小鼠，并取小鼠 肝臟常規(guī)石蠟包埋、切片。 本研究使用自行制備的兔抗TR融合蛋白多克隆血清對實驗組小鼠肝 臟進(jìn)行的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，TR融合蛋白和hEDN蛋白在鼠肝臟 均獲得了陽性表達(dá)，而分別用未免疫正常兔血清和磷酸鹽緩沖液代替一抗 的染色結(jié)果，以及正常對照組鼠肝臟的染色結(jié)果均為陰性。此外，實驗組 小鼠肝臟的HE染色除發(fā)現(xiàn)肝組織局部有輕微的淋巴細(xì)胞浸潤外未發(fā)現(xiàn)其 它明顯的病理變化。 本課題成功構(gòu)建了乙型肝炎病毒靶向核糖核酸酶基因的重組腺病毒 載體AdTR及其對照載體AdTRm、AdhEDN、AdHBC和空的重組腺病毒載體， 并擴增獲得了高滴度的AdTR和AdhEO、重組腺病毒顆粒;分別感染正常小 第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文 鼠后在其肝臟獲得了TR融合蛋白和hEDN蛋白的陽性表達(dá)。實驗證明，使 用人腺病毒載體將目的基因?qū)胄∈蟾渭?xì)胞的基因治療方法是高效的、可 行的。本研究的結(jié)果為HBV一TR重組腺病毒載體下一步在乙型肝炎小動物 模型體內(nèi)的抗病毒作用研究，以及為探索新的乙型肝炎基因治療方法打下 了良好的基礎(chǔ).
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號】：R346

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