【摘要】： 甘露聚糖結合凝集素(mannan-binding lectin，MBL)是哺乳動物C型凝集素超級家族中膠凝素家族成員，主要由肝細胞分泌，作為糖蛋白存在于血漿中。MBL通過與2個MBL相關絲氨酸蛋白酶(MBL associated serine protease，MASP-1，MASP-2)結合而激活補體凝集素途徑，在天然免疫中發(fā)揮重要作用�，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)3個可導致血清(漿)MBL水平低下并進而引起調理吞噬缺損的MBL結構基因點突變：CGT52TGT、GGC54GAC和GGA57GAA，其編碼產物的改變分別是Arg→Cys、Gly→Asp及Gly→Glu。這些點突變?yōu)槌Ｈ旧w顯性遺傳，其基因頻率在不同種族人群中差異甚大，但總體來說極高，如第52位密碼突變在所研究過的人群中相對較低(≤0.1)，第54位密碼突變在歐亞人群中有較高頻率(0.11～0.14)，而第57位密碼突變存撒哈拉非洲人群中的頻率很高(0.23～0.29)。顯然，MBL缺損是迄今所發(fā)現(xiàn)的最常見的遺傳性免疫缺損病，而各種病原體的反復感染與MBL缺損密切相關。然而，MBL基因突變引起免疫缺損的機理迄今尚未完全清楚。 本課題組曾將相同質量數(shù)的野生型和3種突變型MBL真核表達載體用脂質體法分別轉染入相同數(shù)目的COS7細胞中，72h后檢測各目的蛋白的分泌量。將4種(1種野生型基因轉染COS7和3種突變型基因轉染COS7)細胞培養(yǎng)上清中檢測出的蛋白進行One-way ANOVA分析，發(fā)現(xiàn)4種細胞培養(yǎng)上清中目的蛋白的量沒有顯著性差異(P＞0．05)，由此證明，MBL結構基因點突變并不影響MBL蛋白的合成與分泌。 既然MBL結構基因點突變并不影響蛋白的合成與分泌，那是什么原因導致了血清(漿)MBL水平低下，是突變蛋白結構不穩(wěn)定還是功能異常?為了進一步闡明MBL的結構與功能的關系，揭示MBL缺損的實質，我們需要得到野生型和突變型MBL基因的穩(wěn)定表達產物，以便研究其生物學特性。在本研究中，我們將本室保存的已轉染4種真核表達載體(pcDNA4／HisMax C-MBLw、pcDNA4／HisMax C-MBLm52、pcDNA4／HisMax C-MBLm54和pcDNA4／HisMaxC-MBLm57)的CHO細胞株(CHO-MBLw、CHO-MBLm52、CHO-MBLm54和CHO-MBLm57)進行為期2個月的篩選，通過雙抗體夾心ELISA技術篩選得到了高效穩(wěn)定表達目的蛋白的單克隆細胞株，并對其表達的蛋白產物進行了較為深入的研究。將轉染空載體pcDNA4／HisMax C的CHO細胞進行平行處理，作為陰性對照，命名為CHO-pcDNA4C。 一、雙抗夾心ELISA體系的建立 建立了兩種雙抗體夾心ELISA體系，用于檢測培養(yǎng)上清中目的蛋白的濃度，篩選穩(wěn)定高效表達株。第一種夾心體系：利用MBL是多聚體的特性，捕獲抗體為鼠抗人MBL-CRD mAb，檢測抗體為Biotin-抗MBL-CRD mAb，推測由于空間位阻的關系，該體系檢測靈敏度不夠，僅為2.5 mg／L；第二種夾心體系：捕獲抗體為鼠抗人MBL-CRD mAb，檢測抗體為商品化HRP-抗HisG單克隆抗體，該體系靈敏度為0.3 mg／L。檢測用標準品均為野生型重組人MBL蛋白。 二、野生型和突變型MBL基因穩(wěn)定轉染CHO細胞及其高效表達株的篩選 本課題組前期工作已成功構建含有4種真核表達載體的CHO細胞，即CHO-MBLw、CHO-MBLm52、CHO-MBLm54和CHO-MBLm57。將上述細胞分別復蘇后，在96孔板中單克隆化，待細胞克隆長至孔底的1／4后，挑取細胞株置12孔板內培養(yǎng)24 h后，以800 mg／L的Zeocin加壓篩選。隨后的1個月中，每隔3～5天換液一次，維持Zeocin濃度為800 mg／L。分別得到4、1、2、5株穩(wěn)定高效單克隆細胞株，ELISA檢測上清中目的蛋白濃度均達到1～2 mg／L。RT-PCR分析表明，轉染4種MBL基因的CHO細胞均穩(wěn)定轉錄mRNA。 三、野生型和突變型MBL基因在CHO細胞中的表達產物生物學特性研究 利用鼠抗人MBL-CRD mAb親和層析柱初步純化表達產物，Ni~(2+)-NTAagarose層析柱進一步純化表達產物，獲得野生型和突變型重組MBL蛋白。在1L培養(yǎng)上清中均狀得1 mg左右的目的蛋白。經Western blot和ELISA鑒定，純化后的蛋白產物可分別與抗MBL-CRD單克隆抗體、抗His單克隆抗體和抗MBL單克隆抗體結合。它們分別命名為野生型MBL蛋白和32Cys、34Asp、37Glu突變型MBL蛋白。通過SDS-PAGE和Western blot分析，發(fā)現(xiàn)重組突變MBL蛋白以雙鏈(Mr約50 000)為主，而重組野生型MBL分子則以二至六聚體(Mr150 000～450 000)為主。結果表明，突變蛋白的多聚化程度遠遠低于野生型MBL蛋白。酵母菌凝集試驗顯示：人血漿天然MBL和野生型MBL蛋白能結合酵母菌細胞壁甘露聚糖，產生可見的凝集顆粒，3種突變型MBL蛋白凝集顆粒極少；配體結合實驗表明，只有天然MBL和重組野生型MBL蛋白才能與甘露聚糖有效結合，3種突變型MBL蛋白與糖結合的功能低下：補體C3d沉積試驗顯示，3種突變型MBL蛋白不能通過凝集素途徑激活補體系統(tǒng)。 綜合上述資料及本室蔡學敏博士的MASPs結合試驗結果即3種突變型MBL蛋白與MASP-1、MASP-2的結合能力降低，我們認為，CGT52TGT、GGC54GAC和GGA57GAA MBL基因點突變引起的氨基酸殘基的替換影響了其產物蛋白質的結構，使之不能形成結構業(yè)單位及其寡聚體，進而影響其功能，，包括結合配體、MASPs的能力和激活補體凝集素途徑的活性。
【圖文】：

Fig.l一 1ThesensibilityofthesamesandwishELISAdetectingthePurifiedwildtyPerhMBL1.2.2不同種抗體夾心ELISA體系該檢測體系靈敏度較高，可檢測到濃度為 0.3mg/L的蛋白(圖1一2) 2.5乃一任OC的寸哎 0.5 40201052.51.250.6250.3125 ConCentrationoftheWildfyPeMBL(mg/L)圖卜2不同種雙抗夾心ELISA檢測純化重組人野生型MBL蛋白的靈敏度 F19.1一 2ThesensibilityofthedifferentsandwishELISAdeteetingthe

后的l個月中，每隔3一5天換液一次，維持Zcocin濃度為80om妙，獲得穩(wěn)定轉染表達載體的CHO一MBLw、CHO一MBLm52、CHO一MBLm54和CHO一MBLm57單克隆細胞株(圖2一1)。對照組CHO細胞在加壓9天內全部死亡。2.2.2高效表達目的蛋白細胞克隆的獲得(l)在EUSA檢測體系中，以鼠抗人MBL一 CRDmAb為捕獲抗體，HRP-抗HisG單克隆抗體為檢測抗體，檢測篩選得到的各陽性克隆培養(yǎng)上清的A450nm值，共獲得12株A450nm值)0.7的細胞克隆。(2)同時以40m叭至0.3125m叭倍比稀釋的純化重組野生型MBL蛋白為標準蛋白，測得各濃度蛋白參與該ELISA反應的OD值。以標準蛋白濃度為自變量X，ELISA檢測的OD值為應變量Y，進行非線性多項式回歸分析和三次模型曲線擬合(圖2一2)。其決定系數(shù)擴一0.98943
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R392

【參考文獻】

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本文編號：2663326