【摘要】： 結核病(tuberculosis，TB)是由結核分枝桿菌(MTB)引起的以呼吸道傳播為主的慢性傳染病。據(jù)WHO估計，目前全世界約有1/3人口感染MTB，每年有1000萬新發(fā)患者和300萬患者死亡。貧窮、人口增加、流動人口增多、耐藥MTB增多及艾滋病流行等使TB問題雪上加霜。我國是全球22個TB高負擔國家之一，現(xiàn)有MTB感染人數(shù)已達4億，傳染性TB患者達到200萬。卡介苗(BCG)雖被廣泛用于預防TB，但其效果仍不夠滿意。研究認為BCG可預防并減輕兒童的嚴重TB，但對成人肺TB的預防作用從0到80％不等。導致此現(xiàn)象的原因在于BCG菌株的變異使保護性抗原丟失、人群間遺傳或營養(yǎng)的差異及環(huán)境等因素的影響。鑒于BCG自身的不足，以及當前TB流行的嚴重性，研究新的疫苗用于TB的預防已成為當前國內(nèi)外研究熱點。 目前正在研究的TB疫苗包括亞單位疫苗、基因疫苗、減毒活疫苗和重組BCG(rBCG)等。rBCG是利用基因工程技術將外源基因導入BCG中，依靠BCG在宿主內(nèi)的復制，表達特定的外源抗原，以誘導對某些疾病的特異性體液和細胞免疫。rBCG集佐劑和載體于一身、兼不同的外源基因與活疫苗于一體，一次接種可獲得強而持久的多種特異性免疫。因此，利用分子生物學和基因工程的方法對BCG進行改造是新型TB疫苗研制 第四軍醫(yī)大學碩士學位論文 的一個重要方向。 M犯的保護性抗原存在于其短期培養(yǎng)物濾液(s T-CF)中。ST-CF主 要是由MTB在生長過程中產(chǎn)生的分泌性分子及胞內(nèi)釋放出的某些分子組 成，含有200多種多膚。其中ESAI’-6蛋白是MTB感染早期介導細胞免疫 應答的主要優(yōu)勢抗原，可致MTB再感染小鼠的一記憶效應T細胞增殖及 IFN一Y早期大量產(chǎn)生，IFN一Y可顯著活化巨噬細胞，提高巨噬細胞對胞內(nèi) MTB的生長抑制作用和殺傷能力。ESAI飛6蛋白僅存于致病的MTB中，而 在各種BCG菌株中均缺失。 本研究首先將ESAI’-6蛋白基因克隆到pDEZ:載體中，構建大腸桿菌- 分枝桿菌穿梭分泌表達質粒pDE22一ESAI’-6，電穿轉化BCG，構建成分泌 表達ESAI’-6蛋白的rBCG菌株。7H9液體培養(yǎng)基培養(yǎng)rBCG，收集培養(yǎng)上 清，用SePhadexG一50凝膠層析粗分離ESAr-6蛋白，小分子蛋白的 Tricine一SDS一PAGE檢測ES戶a’-6，結果顯示有6kDa大小的條帶，表明所構 建的:BCG可分泌表達ESAI’-6蛋白，且dot blotting進一步證實了目的蛋 白的表達。分別接種rBCG和普通BCG于7H9培養(yǎng)液中，37℃振搖培養(yǎng)， 測定不同時間點的0D600nm值，繪制生長曲線。結果表明，rBCG的生長 特性與普通BCG無明顯差別。 用分泌表達ES戶L1’-6蛋白的rBCG和普通BCG分別經(jīng)背部皮下免疫 BALB/c小鼠(免疫劑量均為1護CFu)，，同時設生理鹽水對照組，免疫6w 后，采用不同方法分別測定各組免疫小鼠的特異性體液免疫和細胞免疫水 平。ELISA檢測各組小鼠血清中特異性抗體的結果表明，:BCG和BCG免 疫組的小鼠均產(chǎn)生了抗MTB H37Rv株培養(yǎng)濾液蛋白(CFP)的高滴度抗 體，且rBCG免疫組小鼠血清抗體滴度(l:8000)顯著高于BCG免疫組小 鼠血清的抗體滴度(l:1400)(尸0.05)。分離各免疫組小鼠的脾淋巴細胞， 體外用抗原刺激，MTT法檢測淋巴細胞增殖反應和檢測IFN斗的產(chǎn)生水平。 結果表明，rBCG免疫組的IFN一Y含量達到1 993士1 05p留ml，明顯高于BcG 免疫組的1463士107 pg/ml(尸0 .05)，而生理鹽水對照組IFN一Y含量只有 230士56p留ml;rBCG免疫組的脾淋巴細胞增殖顯著，其刺激指數(shù)為4.34， 明顯高于BCG免疫組的脾淋巴細胞增殖指數(shù)3.79(尸0.05)，而生理鹽水 對照組淋巴細胞的增殖不顯著，刺激指數(shù)只有1.33。 4 第四軍醫(yī)大學碩士學位論文 綜上所述，分泌表達ESAI’-6蛋白的rBCG與普通BCG相比可刺激 更強的體液免疫應答和細胞免疫應答，但其對MTB感染的保護性等還需 進一步的研究。
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2004
【分類號】：R346

【參考文獻】

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本文編號：2660166