【摘要】： 細(xì)胞凋亡(apoptosis)是細(xì)胞在受到生理或病理刺激后發(fā)生的自發(fā)性的死亡過程。近年研究表明，半胱天冬酶(caspase)家族是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行者。根據(jù)caspase在細(xì)胞凋亡中的不同作用，可將其分為3個亞類：ICE(IL-1β converting enzyme)亞類、凋亡起始亞類(initiator)和凋亡效應(yīng)亞類(effector)。其中凋亡起始亞類包括caspase-2、-8、-9和-10，凋亡效應(yīng)亞類包括caspase-3、-6和-7。 Caspase-8屬于起始caspase，在死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中，caspase-8處于凋亡信號通路的上游，其活化遵循“誘導(dǎo)接近模式”(induced proximity model)，即三聚體化的死亡受體經(jīng)FADD或TRADD募集caspase-8，形成“死亡誘導(dǎo)的信號復(fù)合體”(DISC)，使得caspase-8間相互催化并活化。 1997年，Muzio等證實(shí)，去除氨基端原結(jié)構(gòu)域的caspase-8可以有效地激活 — — caspase習(xí)、J和習(xí)。1998年，S燦vasula等構(gòu)建了大、小亞基次序顛倒的重構(gòu)型人 caspase上和七，它們具有高效的促凋亡活性。由于c卿ase家族分子在結(jié)構(gòu)上具有相 似性，我們推測，大、小亞基次序顛倒的重構(gòu)型人caspaseE也應(yīng)當(dāng)可以自動折疊成 活性型的二聚體結(jié)構(gòu)，并具有持續(xù)的促細(xì)胞凋亡活性。 在本研究中，我們用RT干CR的方法從人Jurkat細(xì)胞系中克隆了人caspase｛ 催化結(jié)構(gòu)域基因。采用重組PCR，構(gòu)建了兩種大、小亞基基因次序顛倒的重構(gòu)型人 caspaseS基因仰和SLL卜隨后，將重構(gòu)的人caspase8基因克隆入真核表達(dá)載體 pllLESZEGFP中，瞬時轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，研究與EGFP共表達(dá)的重構(gòu)型人caspaseE 的促凋亡活性。另外，我們還研究了去除氨基端原結(jié)構(gòu)域（N中rodomain）的caspaseE （即LS）的促凋亡活性。 我們用Western blot、間接免疫熒光等方法證實(shí)了重構(gòu)型人caspaseS基因的表 達(dá)。借助熒光顯微鏡，我們觀察到，與pIRESZ＊GFP空載體轉(zhuǎn)染組比較，SL和SLL 實(shí)驗(yàn)組被轉(zhuǎn)染細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后20小時即出現(xiàn)變圓、皺縮。惜助DAPI染色，可明顯看 到染色質(zhì)固縮等典型的細(xì)胞凋亡特征。該現(xiàn)象也被免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果及電鏡觀 察結(jié)果所證實(shí)。細(xì)胞骨架染色結(jié)果顯示，SL和SLL轉(zhuǎn)染組陽性細(xì)胞沒有完整的細(xì)胞 骨架，細(xì)胞極度皺縮。而同批同時轉(zhuǎn)染空載體的HeLa細(xì)胞仍有大量的EGFP陽性 細(xì)胞貼壁生長，且形態(tài)完好；LS轉(zhuǎn)染組僅見有少量的皺縮、固縮細(xì)胞。借助倒置顯 微鏡，我們看到，SL和SLL轉(zhuǎn)染組培養(yǎng)液中可見大量的懸浮細(xì)胞，而空載體和LS 轉(zhuǎn)染組細(xì)胞仍貼壁生長，狀態(tài)良好，僅見有少量的懸浮細(xì)胞。 因此，我們認(rèn)為，大、小亞基次序顛倒的重構(gòu)型人caspase8門SL和SLL） 可以在細(xì)胞胞質(zhì)中自動折疊成活性型的二聚體結(jié)構(gòu)，，并具有自發(fā)的、持續(xù)的促細(xì)胞 凋亡活性，可以快速、高效的引發(fā)HeLa細(xì)胞凋亡，而去除氨基端原結(jié)構(gòu)域的 caspase毛（即LS）即使過表達(dá)也不足以誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2002
【分類號】：Q78

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