【摘要】： 細胞凋亡(apoptosis)是細胞在受到生理或病理刺激后發(fā)生的自發(fā)性的死亡過程。近年研究表明，半胱天冬酶(caspase)家族是細胞凋亡的關鍵執(zhí)行者。根據(jù)caspase在細胞凋亡中的不同作用，可將其分為3個亞類：ICE(IL-1β converting enzyme)亞類、凋亡起始亞類(initiator)和凋亡效應亞類(effector)。其中凋亡起始亞類包括caspase-2、-8、-9和-10，凋亡效應亞類包括caspase-3、-6和-7。 Caspase-8屬于起始caspase，在死亡受體介導的細胞凋亡中，caspase-8處于凋亡信號通路的上游，其活化遵循“誘導接近模式”(induced proximity model)，即三聚體化的死亡受體經FADD或TRADD募集caspase-8，形成“死亡誘導的信號復合體”(DISC)，使得caspase-8間相互催化并活化。 1997年，Muzio等證實，去除氨基端原結構域的caspase-8可以有效地激活 — — caspase習、J和習。1998年，S燦vasula等構建了大、小亞基次序顛倒的重構型人 caspase上和七，它們具有高效的促凋亡活性。由于c卿ase家族分子在結構上具有相 似性，我們推測，大、小亞基次序顛倒的重構型人caspaseE也應當可以自動折疊成 活性型的二聚體結構，并具有持續(xù)的促細胞凋亡活性。 在本研究中，我們用RT干CR的方法從人Jurkat細胞系中克隆了人caspase｛ 催化結構域基因。采用重組PCR，構建了兩種大、小亞基基因次序顛倒的重構型人 caspaseS基因仰和SLL卜隨后，將重構的人caspase8基因克隆入真核表達載體 pllLESZEGFP中，瞬時轉染HeLa細胞，研究與EGFP共表達的重構型人caspaseE 的促凋亡活性。另外，我們還研究了去除氨基端原結構域（N中rodomain）的caspaseE （即LS）的促凋亡活性。 我們用Western blot、間接免疫熒光等方法證實了重構型人caspaseS基因的表 達。借助熒光顯微鏡，我們觀察到，與pIRESZ＊GFP空載體轉染組比較，SL和SLL 實驗組被轉染細胞在轉染后20小時即出現(xiàn)變圓、皺縮。惜助DAPI染色，可明顯看 到染色質固縮等典型的細胞凋亡特征。該現(xiàn)象也被免疫細胞化學染色結果及電鏡觀 察結果所證實。細胞骨架染色結果顯示，SL和SLL轉染組陽性細胞沒有完整的細胞 骨架，細胞極度皺縮。而同批同時轉染空載體的HeLa細胞仍有大量的EGFP陽性 細胞貼壁生長，且形態(tài)完好；LS轉染組僅見有少量的皺縮、固縮細胞。借助倒置顯 微鏡，我們看到，SL和SLL轉染組培養(yǎng)液中可見大量的懸浮細胞，而空載體和LS 轉染組細胞仍貼壁生長，狀態(tài)良好，僅見有少量的懸浮細胞。 因此，我們認為，大、小亞基次序顛倒的重構型人caspase8門SL和SLL） 可以在細胞胞質中自動折疊成活性型的二聚體結構，，并具有自發(fā)的、持續(xù)的促細胞 凋亡活性，可以快速、高效的引發(fā)HeLa細胞凋亡，而去除氨基端原結構域的 caspase毛（即LS）即使過表達也不足以誘導HeLa細胞凋亡。
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2002
【分類號】：Q78

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本文編號：2660376