【摘要】： 心肌是終分化組織，不能再生，而且心臟內(nèi)沒有心肌干細(xì)胞，，因此心肌受到損傷后只能形成疤痕組織來修復(fù)，最后導(dǎo)致終末期心力衰竭，死亡。近年來，研究人員開始尋求以細(xì)胞移植的方法治療心力衰竭、心肌缺血及擴(kuò)張性心肌病等心臟病，緩解終末期心臟病的心室重構(gòu)，減少死亡率，提高生活質(zhì)量。用于細(xì)胞移植的種子細(xì)胞較多，有成肌細(xì)胞(即骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞)，骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，胚胎、新生或成年的心肌細(xì)胞，胚胎或幼年組織的平滑肌細(xì)胞等，其中成肌細(xì)胞移植研究應(yīng)用較多。 成肌細(xì)胞移植后即在心肌的環(huán)境中，發(fā)生何種變化，是否能與心肌細(xì)胞形成閏盤似的電機(jī)械連接，即形成功能合胞體，既是研究熱點(diǎn)又存在許多分歧，由于體內(nèi)系統(tǒng)較復(fù)雜，常受到許多因素的影響，本實(shí)驗(yàn)建立體外成肌細(xì)胞與心肌細(xì)胞共同培養(yǎng)模型，模擬機(jī)體心臟內(nèi)環(huán)境，研究心肌細(xì)胞與成肌細(xì)胞的相互影響和作用，另外本實(shí)驗(yàn)還詳細(xì)介紹了分離、提純和鑒定成肌細(xì)胞方法及其生長的生物學(xué)特性。 方法： 本實(shí)驗(yàn)采用原代培養(yǎng)的方法，以膠原酶Ⅰ和胰蛋白酶混合消化法獲取成肌細(xì)胞，以非連續(xù)密度梯度離心法(Percoll分離液)分離、純化成肌細(xì)胞；倒置光學(xué)顯微鏡下觀察成肌細(xì)胞生物學(xué)特 第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文 性，繪制成肌細(xì)胞生長曲線;透射電鏡下觀察其超微結(jié)構(gòu);以一 抗a一Actin，Desmin單克隆抗體及SABC免疫組織化學(xué)染色法鑒 定成肌細(xì)胞;在自主跳動的成肌細(xì)胞中加入異丙腎上腺素 (Isoproteren。l，IP)使終濃度為20一7m口z嚨一I，研究細(xì)胞對xP的反 應(yīng)性，分加藥前和加藥后兩組，計數(shù)細(xì)胞自發(fā)跳動頻率，進(jìn)行統(tǒng) 計學(xué)分析。 建立成肌細(xì)胞與心肌細(xì)胞體外聯(lián)合培養(yǎng)的模型:在體外分別 分離、提純成肌細(xì)胞和心肌細(xì)胞，以1:1細(xì)胞數(shù)混合(濃度均為 lxlos一，)接種于培養(yǎng)板中，觀察其生長特性;在聯(lián)合培養(yǎng)的第 5天收集聯(lián)合培養(yǎng)的細(xì)胞，常規(guī)脫水、固定后在透射電鏡(JEM一 2000EX)下觀察是否存在橋粒和縫隙連接;取聯(lián)合培養(yǎng)5天的活 細(xì)胞爬片在倒置顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞微注射研究，在以微電極刺入 成肌細(xì)胞中，以自主擴(kuò)散及方波電泳的方式使活化生物素 (Biocytin)分布擴(kuò)散于成肌細(xì)胞中，固定后，以德克薩斯紅標(biāo) 弓 記的卵白素作為二抗標(biāo)記，熒光顯微鏡下觀察顯色部位。 結(jié)果: 膠原酶I和胰蛋白酶混合消化法能較好的分離成肌細(xì)胞，以 Percoll液非連續(xù)密度梯度離心法為分離、提純細(xì)胞獲得成肌細(xì)胞 的純度可達(dá)95%;成肌細(xì)胞多呈梭形或紡錘形，培養(yǎng)4至5天就 可見有的細(xì)胞相互融合形成肌管;成肌細(xì)胞抗a一Actin和Desmin 染色相似，熒光為紅色，多為橢圓形或圓形核的單核細(xì)胞，少數(shù) 亦有雙核;透射電鏡下成肌細(xì)胞核仁有1一3個，胞漿中有不規(guī)則 分布的肌絲，部分區(qū)域尚未形成，有成熟的線粒體、糖原、和游 離的核糖體和溶酶體。原代培養(yǎng)成肌細(xì)胞融合后2一3天可以看到 纖維的自發(fā)收縮，頻率50一160次/分，加入IP后，細(xì)胞收縮頻率 增加約22.5%，統(tǒng)計學(xué)處理得p0.05，具有統(tǒng)計學(xué)意義，IP對成肌 細(xì)胞有正性變時作用。 聯(lián)合培養(yǎng)的成肌細(xì)胞和心肌細(xì)胞，光鏡下可見兩者如心肌細(xì) 第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文 胞團(tuán)樣同步收縮;在透射電鏡下很容易見到兩者形成的橋粒連接， 但較難見到間隙連接;微電極注入成肌細(xì)胞后，免疫組織化學(xué)染 色可見:在與注入活化生物素的成肌細(xì)胞鄰近的心肌細(xì)胞出現(xiàn)生 物素的紅色染色，說明生物素可以從成肌細(xì)胞通過兩者之間形成 的間隙連接進(jìn)入心肌細(xì)胞，而使心肌細(xì)胞顯色。 結(jié)論: 1:膠原酶I和胰蛋白酶混合消化法能較好的消化獲得成肌細(xì) 胞，以Percon液密度梯度離心法是一種簡便、有效分離提純成肌 細(xì)胞的方法; 2:介紹了成肌細(xì)胞的生物學(xué)特性，并詳細(xì)描述了它的自發(fā)跳 動特性，成肌細(xì)胞可能表達(dá)p受體; 3:成肌細(xì)胞與心肌細(xì)胞體外聯(lián)合培養(yǎng)可形成有橋粒和縫隙連 接組成的電機(jī)械連接，證實(shí)說明成肌細(xì)胞移植到心肌內(nèi)，有與心 肌細(xì)胞形成閏盤的可能; 4:成肌細(xì)胞是進(jìn)行細(xì)胞移植是一種有前景的種子細(xì)胞，這種 體外聯(lián)合培養(yǎng)的方法是研究移植機(jī)制良好的方法。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號】：R329.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2657690