【摘要】：研究背景及目的 在多器官功能衰竭(multiple organ failure, MOF)和全身性炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)發(fā)生中,來自循環(huán)血液病原體和/或其毒素以及由此而刺激產(chǎn)生的細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子(TNF)和炎癥介質(zhì)如脂多糖(LPS)等,均可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells, ECs)通透性增高。近半個世紀(jì)的研究表明,可引起EC通透性升高的細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)種類繁多,其中雖然有一些因子可直接損傷EC,但絕大多數(shù)是通過使EC肌動蛋白細(xì)胞骨架(actin cytoskeleton)發(fā)生改變,EC發(fā)生收縮和/或回縮,進(jìn)而EC之間的間隙(gap)增大,導(dǎo)致內(nèi)皮通透性增高。近年人們對EC肌動蛋白骨架的內(nèi)在調(diào)節(jié)機(jī)制,以及病理情況下骨架蛋白重新分布(reorganization)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制及與細(xì)胞間隙變化的相關(guān)關(guān)系進(jìn)行了一定的研究,認(rèn)為Rho家族的GTP酶(Rho GTP ases)可能在細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)所致的內(nèi)皮通透性增高中起著主要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。本文主要研究Rho家族中Rac1蛋白在血管EC形態(tài)和通透性變化中的作用,試圖闡明Rac1是否為調(diào)節(jié)EC肌動蛋白細(xì)胞骨架改變的重要信號分子,及其在炎癥介質(zhì)介導(dǎo)的EC單層通透性增高中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。 方法 (1) 根據(jù)Genebank hPBD mRNA序列,設(shè)計合成引物,從EC mRNA中克隆與Rac1和Cdc42相結(jié)合的人PAK1結(jié)合域(human WP=5 p21 binding domain, hPBD),將其插入GST融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化BL21宿主菌,表達(dá)與Rac1/Cdc42相結(jié)合的GST-hPBD融合蛋白,經(jīng)親和層析純化后,用于pull down實驗,測定EC中活化的Rac1蛋白含量。(2)應(yīng)用pull down分析檢測TNF-α和LPS刺激前后EC中Rac1蛋白的活化表達(dá),應(yīng)用Rhodamine-Phalloidin染色,熒光顯微鏡下觀察EC骨架重排。以HRP為示蹤劑測定刺激前后EC通透性的改變。通過上述工作探討EC Rac1活性的變化與細(xì)胞肌動蛋白骨架、細(xì)胞間隙和內(nèi)皮單層通透性改變的關(guān)系。 結(jié)果 (1) DNA序列測定證實重組表達(dá)載體構(gòu)建成功,經(jīng)采用低溫誘導(dǎo)表達(dá)相對分子量為36KD的可溶性GST-hPBD融合蛋白,親和層析純化得到純度大于75%的GST-hPBD融合蛋白,并在pull-down實驗中檢測到活性Rac1蛋白的表達(dá)。(2) Western blot分析證實LPS作用1h,TNF-α作用2h,活化Rac1蛋白表達(dá)明顯增加;LPS作用2h,TNF-α作用4h,Rac1蛋白表達(dá)達(dá)到峰值。(3) 在相應(yīng)濃度劑量下,TNF-α和LPS可明顯增加EC單層的通透性(p0.05),并呈時間依賴性。(4) 熒光倒置顯微鏡下,正常血管EC形態(tài)呈規(guī)則圓形、多角形,排列緊密、整齊,細(xì)胞與細(xì)胞間和細(xì)胞基底膜之間的粘附連接緊湊,基膜完整,無明顯的細(xì)胞間隙形成。TNF-α和LPS作用后細(xì)胞形態(tài)由圓形、多角形變成梭形,長寬比增大,細(xì)胞收縮,細(xì)胞間隙明顯增大,排列紊亂。(5) 正常對照組EC F-actin主要分布于細(xì)胞膜側(cè),少量呈細(xì)絲狀無序地分布于胞漿,核周偶有應(yīng)力纖維形成。LPS、TNF-α刺激后EC內(nèi)F-actin的構(gòu)像和分布發(fā)生變化,邊聚現(xiàn)象消失,胞漿內(nèi)的F-actin明顯增多,出現(xiàn)大量的應(yīng)力纖維,并呈極性分布,呈典型竹排樣結(jié)構(gòu)�；罨疪ac1蛋白表達(dá)的增加與EC通透性增加、EC形態(tài)及細(xì)胞骨架變化在時相上具有相關(guān)性。 結(jié)論 hPBD原核表達(dá)載體的成功構(gòu)建及融合蛋白的表達(dá)純化,為我們進(jìn)一步探討Rho GTPases的活性改變提供了一個良好的實驗方法和實驗基礎(chǔ)。同時,細(xì)胞因子TNF-α和炎癥介質(zhì)LPS刺激引起的細(xì)胞內(nèi)皮通透性改變和細(xì)胞內(nèi)骨架重排,與細(xì)胞內(nèi)活化Rac1蛋白的 WP=6 增加在時相上密切相關(guān),提示Rac1蛋白可能在肌動蛋白骨架及細(xì)胞間隙改變和內(nèi)皮單層通透性的增高中起著信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。
【圖文】：

圖 1 hPBD RT-PCR 產(chǎn)物電泳分析1: hPBD 產(chǎn)物; 2: DL2000 DNA marker組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定R 擴(kuò)增 hPBD 基因片段，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) BamHⅠ和 E入 pGEX-2T 原核表達(dá)載體中連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌T-2T/hPBD 融合蛋白基因的重組質(zhì)粒，構(gòu)建過程如組菌提取質(zhì)粒 DNA 雙酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳為 4.9Kb 和 270bp，與理論值相符，見圖 3。

圖 3 重組質(zhì)粒的限制性內(nèi)切酶分析1: 重組質(zhì)粒 pGEX-2T/hPBD 經(jīng) BamH I/EcoR I 酶切;2: DL2000 DNA marker三．重組質(zhì)粒 DNA 序列測定重組表達(dá)質(zhì)粒測序結(jié)果如圖 4 所示，，重組質(zhì)粒中所含的目的與 Genebank 的 hPBDcDNA 開放閱讀框架序列完全一致，證表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建正確。
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號】：R346

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2657390