【摘要】： 背景：弓形蟲是一種專性細(xì)胞內(nèi)的寄生原蟲，呈世界性分布，能引 起人獸共患的弓形蟲病。全世界約有1/3的成年人感染弓形蟲。若孕婦 感染弓形蟲，則蟲體可經(jīng)胎盤傳給嬰兒，導(dǎo)致流產(chǎn)、畸胎；而在腫瘤患 者、AIDS病人等免疫功能嚴(yán)重受損者，作為一個主要的機(jī)會致病因 子，弓形蟲是引發(fā)致死性病變的主要病原之一。因此，為了防治弓形蟲 病，迫切需要研制出一行之有效的弓形蟲疫苗。已有研究表明，弓形蟲 的主要表面抗原P30具有很強(qiáng)的免疫原性，是非常理想的候選疫苗分 子。與傳統(tǒng)疫苗相比，90年代發(fā)展起來的核酸疫苗技術(shù)因其潛在的優(yōu)勢 使其得到迅速而廣泛的應(yīng)用。目前，弓形蟲核酸疫苗的研究也取得了一 些進(jìn)展，已經(jīng)證實(shí)用編碼弓形蟲P30抗原的質(zhì)粒DNA進(jìn)行核酸免疫， 能夠引起特異性的抗感染免疫應(yīng)答，但是，弓形蟲P30基因不同表達(dá)形 式的重組質(zhì)粒所產(chǎn)生的免疫效果如何，尚不得而知。 目的：通過構(gòu)建含弓形蟲P30基因不同表達(dá)形式（膜型、分泌型及 細(xì)胞內(nèi)型）的重組質(zhì)粒，并將其免疫小鼠，測定抗體水平，以期初步篩 選出一種對弓形蟲感染具有良好保護(hù)作用的核酸疫苗分子。 方法：1、弓形蟲表膜型P30基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建：設(shè)計(jì)并合成了一 對引物，利用PCR技術(shù)，從弓形蟲ZS1株的基因組DNA中擴(kuò)增出完整 的P30編碼序列（包括信號肽及疏水尾），將其克隆到真核表達(dá)載體 pcDNA中，構(gòu)成pcDNA3-P30Mb。 2、弓形蟲分泌型P30基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建：回收純化PCR擴(kuò)增的 P30基因片段，用PstI切去C端的疏水氨基酸序列，再克隆到pcDNA 中，構(gòu)成pcDNA3-P30Se。 3、弓形蟲細(xì)胞內(nèi)型P30基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建：用限制性內(nèi)切酶 EcoRI和BamHI將重組質(zhì)粒pBV220-P30In的小片段切下，亞克隆到 pcDNA中，目為pcDNA3-P30In。 4、將質(zhì)粒DNA與lipofectin以5:2的比例混合，經(jīng)小鼠股四頭肌 注射，5ug/只。2周后，加強(qiáng)注射一次。分別于免疫前及免疫后2周、4 周、6周自小鼠尾靜脈采血，用Westernblot和ELISA檢測IgG抗體水 5、誘導(dǎo)含昨T－A SP30 A PI的工程菌表達(dá) P30蛋白并純化，免疫印 D 跡測定其免疫活性，以用于檢測小鼠血清中的特異性抗體。同時，對純D D 化條件進(jìn)行優(yōu)化。D l 結(jié)果：l、經(jīng)雙酶切鑒定及DNA序列測定，三種重組質(zhì)粒中的插入 l l 片段確為弓形蟲P30的編碼基因且讀碼框架正確。l 12、小鼠血清中IgG抗體的檢測：免疫印跡顯示，免疫后2周，除l D 細(xì)胞內(nèi)型重組質(zhì)粒免疫組外，膜型及分泌型兔疫組均出現(xiàn)較弱的反應(yīng)D 帶，且前者顯色略淺，在免疫后4周和6周，三個兔疫組均顯示IgG抗 體反應(yīng)帶，且各組之間顏色深淺無明顯差異。另一方面，從IgG抗體產(chǎn) l 生的時間進(jìn)程來看，免疫后2周，抗體反應(yīng)帶較弱，，而在免疫后4周和l 16周，抗體反應(yīng)顯著增強(qiáng)，同時也可看出，4周和6周的反應(yīng)帶深淺無l 明顯變化。ELISA定量結(jié)果顯示，空載體pCDNA3注射組與三種重組質(zhì) D 粒注射組之間有顯著性差異o功刀5），說明弓形蟲P3O基因的重組質(zhì)D 粒確實(shí)能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體；免疫后2周，pcDNA3I30In注 射組與PcDNA3P30Mb和PcDNA3I30Se注射組之間的差別具有顯著 。＠u＜0．05），thegM＃ZredIBARgH0＞0．05）；the＆＆s 4 N和～ 16周，三個免疫組之間的 IgG抗體水平無顯著性差異0＞0．05）；同 l ＃，）A IgG ftWPI％rtfedsfg＄％，m＆ti 2 MghffiW7k4K（ff，f～ l 了第4周和6周時，各免疫組的IgG抗體均較二周時明顯增加，但4周l l 和 6周之間的 IgG抗體水平無明顯變化0＞0．05），表現(xiàn)為一平臺期。l 13、純化蛋白能與弓形蟲病人陽性血清反應(yīng)，出現(xiàn)了特異性反應(yīng)l Iw。l 14、經(jīng)免疫印跡顯示，濃縮至初始體積的1／3刁歷時，純化蛋白的反”l D 應(yīng)帶顏色最深，說明此時有活性的純化蛋白的濃度最高。D 結(jié)論：l、成功地構(gòu)建了弓形蟲P30基因三種表達(dá)形式的重組質(zhì) D 粒。D 12、用編碼P30抗原的重組質(zhì)粒進(jìn)行核酸免疫，能夠誘導(dǎo)免疫小鼠 l 產(chǎn)生特異性的IgG抗體。膜型及分泌型重組質(zhì)粒誘導(dǎo)IgG抗體的出現(xiàn)先 于細(xì)胞內(nèi)型。但隨著時間延長，其抗體水平無明顯差別。因此，就產(chǎn)生 IIgG抗體而言，三種重組質(zhì)粒的免疫效果是基本相同的。l 3、本方法表達(dá)純化的P30蛋白具有免疫學(xué)活性，可用于體外檢 測。在純化過程中，最佳濃縮程度是濃縮至初始體積的1／3－l／6，此時， D 有活性的純化蛋白濃度最高。
【學(xué)位授予單位】：第一軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2000
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前6條

1 劉文軍,楊芙蓉,阮力,任貴方,朱既明;三種病毒啟動子在中國地鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中表達(dá)活性的比較[J];病毒學(xué)報(bào);1997年02期

2 陳曉光，劉國章，徐帆，王 章，江靜波;弓形蟲主要表面抗原基因的克隆[J];第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);1994年02期

3 陳曉光,劉國章;弓形蟲P30基因在昆蟲桿狀病毒載體體系中的初步表達(dá)[J];寄生蟲與醫(yī)學(xué)昆蟲學(xué)報(bào);1996年01期

4 沈繼龍,徐秉錕;弓形體抗原的免疫化學(xué)研究[J];中國人獸共患病雜志;1990年04期

5 沈繼龍,夏惠,馬濟(jì)宏;弓形蟲表膜主要分子抗原的免疫印跡分析[J];中國人獸共患病雜志;1993年04期

6 周永安,陳觀今,郭虹,鄭煥欽,呂芳麗;弓形蟲P30基因DNA免疫小鼠誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答[J];中國人獸共患病雜志;1999年03期

本文編號：2657343