【摘要】： 毋庸置疑，異基因造血細(xì)胞移植是治療多種造血系統(tǒng)惡性病、遺傳性疾病、重癥聯(lián)合免疫缺陷病以及重度放射病等頑疾的有效方法之一，而供-受體主要組織相容性抗原(HLA)相合與否是移植成敗的關(guān)鍵因素。隨著我國獨(dú)生子女的不斷成長與增多以及骨髓庫和臍血庫的相繼建立，非親緣供-受體造血細(xì)胞移植無疑將是今后臨床造血細(xì)胞移植的必然趨勢(shì)。大量資料表明，HLA不完全相合造血細(xì)胞移植的排斥率、死亡率和GVHD發(fā)生率均明顯高于HLA完全相合的供-受體移植，而且移植后患者免疫功能的重建緩慢，致命性感染機(jī)會(huì)增加。因此，移植成功的重要前提是要對(duì)供-受者HLA進(jìn)行精細(xì)的分型。然而，由于人類HLA的高度復(fù)雜性、多態(tài)性(polymorphism)和多樣性(diversity)，建立一種準(zhǔn)確、快速、簡便、靈敏、特異、高分辨、低成本和高通量的HLA分型系統(tǒng)則已成為亟待解決的重要問題。 我們知道，迄今為止HLA系統(tǒng)共發(fā)現(xiàn)1620個(gè)等位基因，其中僅A位點(diǎn)就有266個(gè)等位基因，B位點(diǎn)有511個(gè)等位基因，DRB位點(diǎn)有403個(gè)等位基因。目前，國際上應(yīng)用最為廣泛的HLA基因分型方法是PCR-SSP技術(shù)，這是一種成熟、快速而且比較準(zhǔn)確的分型方法。但由于PCR-SSP方法只能對(duì)已知基因序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，而對(duì)于未知的等位基因則無法判定，這就必然會(huì)造成分型的結(jié)果錯(cuò)判或誤判，尤其是會(huì)漏檢新的等位基因，再加上其分辨率較低、檢測標(biāo)本規(guī)模較少和成本較高等缺陷，遠(yuǎn)不能滿足當(dāng)今臨床上移植應(yīng)用的需要。而融構(gòu)象與測序于一體的參照鏈介導(dǎo)的構(gòu)象分析(reference strand mediated conformation analysis, 早祥靄陣呂受駕冷才泣卜駕冷店乞石i反d匕駕冷毛立‘翻全二了匕 RSCA)系統(tǒng)的出現(xiàn)則能較為圓滿地解決這些不足。 RSCA分型策略的基本原理是利用HLA位點(diǎn)特異性引物PCR擴(kuò)增不同等位基 因，然后與Cys標(biāo)記的熒光標(biāo)記參照鏈進(jìn)行雜交，根據(jù)雜交雙鏈的空間結(jié)構(gòu)不同 所致在非變性聚丙烯酞胺凝膠電泳中的遷移率不同，通過激光掃描可檢測并記錄 各條熒光標(biāo)記雜交雙鏈在凝膠中的遷移率，最后根據(jù)已知的RSCA數(shù)據(jù)庫對(duì)各等 位基因進(jìn)行型別指定。該分型系統(tǒng)不僅能鑒定出既定位點(diǎn)所有的已知等位基因， 而且還能發(fā)現(xiàn)未知的新等位基因;在實(shí)驗(yàn)中可根據(jù)不同位點(diǎn)的多態(tài)性情況來選擇 不同數(shù)量的熒光標(biāo)記參照鏈，如對(duì)HLA一A位點(diǎn)來說選擇2條參照鏈就可將其所有 的等位基因區(qū)分開來;而對(duì)多態(tài)性最多和最復(fù)雜的HLA一B位點(diǎn)來講，則需選擇三 條熒光標(biāo)記參照鏈，從而達(dá)到高分辨率的目的;此外還具有高通量檢測的特點(diǎn)， 如本研究所采用的為非變性聚丙烯酞胺凝膠電泳，一次可上樣18個(gè)HLA一A位點(diǎn)或 12個(gè)HLA一B位點(diǎn)樣品;由于在每一電泳樣品中均需加入雜交雙鏈Marker，以及在 選定的1、14、27和40四條泳道中均加入雜交雙鏈Ladder，這就確保了在同一凝膠 中不同泳道間與不同凝膠間電泳結(jié)果指定的統(tǒng)一性，消除了不同泳道和不同凝膠 間電泳遷移率的誤差，使實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性得以提高;最可取的是，通過激 光檢測儀掃描電泳條帶，能自動(dòng)記錄各電泳條帶的電泳遷移率，配以相關(guān)智能軟 件分析最終結(jié)果，從而實(shí)現(xiàn)了結(jié)果分析的智能化，減少了人為判斷的誤差。為了 推動(dòng)這一分型新策略在世界范圍內(nèi)的廣泛應(yīng)用，國際免疫遺傳協(xié)會(huì)于2001年成立 了包括本研究室在內(nèi)的國際上7個(gè)著名HLA實(shí)驗(yàn)室參加的國際HLA一RSCA協(xié)作 組。因此，本研究首先建立健全RSCA分型系統(tǒng)，并通過國際參比DNA標(biāo)本對(duì)系 統(tǒng)的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性、可復(fù)性及特異性進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化驗(yàn)證。在此基礎(chǔ)上，在首次將 RSCA分型系統(tǒng)應(yīng)用于臨床移植標(biāo)本的分型中，分別對(duì)84例和90例(共123例，其 中51例兩個(gè)位點(diǎn)均有)擬進(jìn)行造血干細(xì)胞移植供一受體的HLA一A和B位點(diǎn)進(jìn)行了 RSCA與PCR一SSP分型方法的比較分析，以進(jìn)一步確定RSCA在基礎(chǔ)研究及臨床實(shí) 踐中的應(yīng)用價(jià)值。 本研究第一部分是建立并穩(wěn)定HLA一A位點(diǎn)的RSCA分型系統(tǒng)。首先采用國 際HLA一RSCA協(xié)作組提供的20例標(biāo)準(zhǔn)分型DNA以及2例PEL一FREEZ公司贈(zèng)送 的樣品DNA進(jìn)行HLA一A位點(diǎn)的RSCA分型，將分型結(jié)果遞交國際HLA一RSCA 舅渾霍羹不徑受竺琴全禾于寫全l資乞子亙反」二三等全{立初全二多〔 協(xié)作組進(jìn)行認(rèn)證比對(duì)，證明本研究所建立的HLA一A位點(diǎn)RSCA分型系統(tǒng)是穩(wěn)定 可靠的，重復(fù)率達(dá)100%。此外，本文還隨機(jī)選用20例臨床標(biāo)本對(duì)RSCA的可復(fù) 性進(jìn)行了一再確定，每例標(biāo)本用RSCA方法重復(fù)3次，重復(fù)率均為100%。隨后， 我們選取84例擬進(jìn)行造血干細(xì)胞移植并來我室進(jìn)行HLA分型供一受體的臨床標(biāo)本 進(jìn)行HLA一A位點(diǎn)的RsCA分型，這些標(biāo)本均已進(jìn)行了HLA一A、B、DR及DQ位 點(diǎn)的PCR一SSP低分辨基因分型。結(jié)果顯示，RSCA分型在81/84例標(biāo)本中均能得 到準(zhǔn)確可靠的結(jié)果，并且有33/84例標(biāo)本可直接得到等位基因水平的分型結(jié)果; 有2例標(biāo)本因DNA濃度太低導(dǎo)致PCR擴(kuò)增較弱，RSCA未能對(duì)其進(jìn)行分析;另 有l(wèi)例標(biāo)本用RSCA方法只能指定1條等位基因，，另1條無法指定，為此我們分 別采用直接測序法和PCR一SSP高分辨技術(shù)對(duì)其進(jìn)行鑒定分型，分型結(jié)果均為 HLA一A*2404，是一條己知等位基因但RSCA數(shù)據(jù)庫中尚未列入的基因型別。而 在PCR一SSP低分辨基因分型的84例標(biāo)本
【圖文】：

在內(nèi)參帶與引物帶之間的DNA擴(kuò)增帶即為陽孔，B圖的陽性帶為第2、14孔。置標(biāo)記在HLA一I類位點(diǎn)PCR一SSP低分辨分型讀本HLA一A位點(diǎn)的分型結(jié)果。這種方法比較快速、異性結(jié)果出現(xiàn)，并且在有的電泳結(jié)果中還常會(huì)出現(xiàn)子量1200bp)，這些都需要重復(fù)實(shí)驗(yàn)。84例臨床標(biāo)詳見表2。點(diǎn)RSCA分型系統(tǒng)的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性及重復(fù)性鑒定型系統(tǒng)對(duì)標(biāo)本HLA一A位點(diǎn)進(jìn)行引物擴(kuò)增后，擴(kuò)增包括HLA一A位點(diǎn)的外顯子2、內(nèi)含子2、外顯子果見圖2。

圖3.HLA一A位點(diǎn)的RSCA分型電泳圖電泳共40個(gè)泳道，第1、14、27、40泳道是Ladde:電泳道，從下向上定義的值分別00，0，1136.8，1253.5，1362.7，1520.9，1729.4及3000.0，箭頭所指為1000和3000的Marke它的電泳泳道也都有1000和3000的標(biāo)準(zhǔn)Marker，其中第2、3泳道為第1個(gè)樣品，道是第1個(gè)樣品與熒光標(biāo)記參照鏈1雜交后電泳結(jié)果，第3泳道是第1個(gè)樣品與熒光標(biāo)照鏈2雜交后的電泳結(jié)果。依次向后排，共可電泳18個(gè)樣品。圖4顯示HLA一A位點(diǎn)RSCA分型結(jié)果峰型圖，雜交鏈電泳峰位于100000的Marker之間，標(biāo)本若為雜合子，則在上下Marker之間有三個(gè)峰(第一為同源參照鏈雜交峰)，見圖4A，若為純合子，則只有兩個(gè)峰，見圖4B。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2657181