【摘要】： 研究背景及目的 在多器官功能衰竭(multiple organ failure，MOF)和全身性炎癥反應綜合癥(systemic infammatory response syndrome，SIRS)中，，引起血管EC單層通透性增高的炎癥介質(zhì)大多數(shù)是通過血管內(nèi)皮細胞(endothelial cell，EC)骨架發(fā)生變化，使EC收縮和回縮，EC間隙增大，EC單層通透性增高，因此，了解EC通透性增高的機制至關(guān)重要。研究顯示，Rho GTPase家族成員特別是RhoA在EC通透性增高中起重要作用，Rho GTP酶通過影響F-actin的聚合來調(diào)節(jié)EC的屏障功能。本課題旨在探討脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)和凝血酶對血管EC單層通透性的影響、EC肌動蛋白細胞骨架改變及其與RhoA mRNA表達之間的關(guān)系；同時用Y-27632(Rho激酶抑制劑)驗證LPS和凝血酶對血管EC單層通透性的影響及與細胞肌動蛋白骨架改變之間的關(guān)系。試圖闡明Rho GTP酶是否為調(diào)節(jié)EC肌動蛋白細胞骨架形成的重要信號分子，在炎癥介質(zhì)介導的EC單層通透性增高的過程中是否起主要的信號轉(zhuǎn)導作用，并探討治療細胞屏障功能損傷的靶位點。 方法 (1)采用Transwell chamber彌散模型，分別檢測不同濃度的凝血酶、LPS對ECV304細胞單層通透性影響；EC經(jīng)10μM Y-27632處理后，觀察凝血酶、LPS對血管EC單層通透性影響。(2)利用異硫氰酸鹽標記的鬼筆堿對EC的肌動蛋白細胞骨架進行染色，用熒光倒置顯微鏡觀察凝血酶和LPS對EC肌動蛋白細胞骨架分布變化及Y-27632阻斷凝血酶和LPS誘導的EC肌動蛋白細胞骨架重排的影響。(3)采用RT-PCR法測定EC中RhoA mRNA的表達，用Bio-Rad凝膠成像分析儀作半定量分析。 結(jié)果 (1)LPS、凝血酶可明顯增加EC單層的通透性(p＜0.05)，呈一定的劑量-時間依賴性。凝血酶在5分鐘內(nèi)使EC單層通透性明顯升高，EC單層通透性在2小時內(nèi)逐漸回落到基線水平；LPS使EC單層的通透性在120分鐘內(nèi)持續(xù)升高。Y-27632可抑制凝血酶和LPS誘導EC單層通透性的增加(p＜0.05)。(2)熒光倒置顯微鏡下，EC的F-actin呈網(wǎng)狀排列，細胞周邊偶有應激纖維形成。LPS和凝血酶 作用lh后，EC肌動蛋白骨架解聚，排列紊亂，F(xiàn)一actin穿越細胞中央，細胞周邊 形成應激纖維，絲狀偽足及層狀偽足，EC明顯回縮，細胞間隙明顯增加。與對照 組相比，用Y一27632處理的EC組的肌動蛋白細胞骨架排列略紊亂，細胞周邊應激 纖維消失，無明顯的絲狀偽足和片狀偽足形成。(3) RT一PCR檢測分析顯示:EC 有Rh0A基因的表達，當LPS和t知舊mbin作用EC后，隨著炎癥介質(zhì)作用濃度的 增加，其表達水平明顯上調(diào)。 結(jié)論在LPS和凝血酶引起EC肌動蛋白細胞骨架解聚及EC單層通透性增高 過程中，.助。A的表達明顯增強，RhoA激酶信號轉(zhuǎn)導途徑被激活、Y一27632可抑 制LPS、凝血酶誘導的EC肌動蛋白細胞骨架解聚及EC單層通透性增高。提示 孫。GTPases在炎癥介質(zhì)介導的EC單層通透性增高的過程中起主要的信號轉(zhuǎn)導作 用，闡明Rho GTP酶在這一病理過程中的作用，將為全身性炎癥反應綜合癥防治 提供新的策略。
【學位授予單位】：大連醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2003
【分類號】：R363

【參考文獻】

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本文編號：2657089