【摘要】：病毒性乙型肝炎是世界范圍內一個嚴重的公眾健康及社會問題，全世界約有4億HBV患者及病毒攜帶者，我國現(xiàn)HBV攜帶者約為1.2億人。以IFN-α為主的藥物治療效果并不理想，且費用高、療程長、停藥后易復發(fā)及長期治療易產生耐藥性。目前最有效、最經濟預防和控制HBV的措施是疫苗接種，但現(xiàn)在的HBV基因工程疫苗存在一定低應答率問題。當務之急是研制一種有效、安全、經濟、使用方便的新型疫苗。 植物基因工程技術的不斷發(fā)展為新型疫苗的研究提供了新的解決方法。植物表達系統(tǒng)具有高效、價廉及使用方便等特點。已取得的成果和進展表明，植物表達系統(tǒng)生產的抗原可保持自然免疫原性，口服后能夠誘發(fā)體液和粘膜免疫反應。 由于pre-S1及pre-S2在HBV與肝細胞受體的粘附中起重要作用，而且在自然感染狀態(tài)下抗pre-S2抗體的產生要早于抗S抗體。pre-S1及pre-S2中存在的T細胞激活表位將有助于提高機體對S抗原的抗體反應水平。因此包含pre-S1及pre-S2的HBV疫苗有助于克服機體對HBV的無應答狀態(tài)。以HBc作為載體來表達高效疫苗已經受到普遍認可，其作為顆粒樣載體具有顯著的優(yōu)越性，可誘導較強的細胞及體液免疫應答。 本研究通過以HBc為載體的HBV preS／S番茄疫苗的研究，探討HBV轉基因番茄作為口服疫苗的可行性，為HBV的預防探討一條新的途徑。先把preS／S基因插入到HBc的第73-94aa處(棘突尖部)，構建了顆粒性表達載體HBc-Hbs；隨后將目的基因克隆到植物表達載體pBIN438上，液氮凍融法轉化農桿菌eha105；用含pBIN438-HBc-Hbs的根癌農桿菌侵染番茄2／3子葉和下胚軸；在MS_2培養(yǎng)基上培養(yǎng)大約35d，在愈傷組織處可見分化苗；待苗長到3cm時，移到MS_3培養(yǎng)基上，根系發(fā)達后，，將完整的植株移栽到土壤中室溫生長，共獲得67株抗性植株。 CTAB法提取植物總DNA，PCR方法鑒定外源HBc-Hbs基因(1177bp)，34株為陽性。考慮到PCR方法的假陽性，進行了PCR-southern 乙型肝炎病毒(HBV)顆粒性抗原轉基因番茄植株的構建及鑒定 blot檢測;為進一步證明HBc一Hbs基因的整合情況，將植物總DNA BamHI 酶切過夜;同時設立經相同酶切的重組質粒pB水438一HBc一Hbs為陽性對 照，以非轉化植株為陰性對照;根據顆粒性表達載體HBc一Hbs兩端序列 設計引物Pl和PZ，以質粒pBIN438一HBc一Hbs為模板，用地高辛標記探 針進行Southem blot雜交分析;通過RT一PCR及Westen blot印跡雜交檢 測目的基因在番茄中的轉錄和翻譯情況。PCR、PCR一Southem blot、 Southem blot結果表明目的基因己整合到番茄的基因組中;RT一PCR、 Westem blot的結果證明目的基因已在番茄中轉錄為mRNA，并成功翻 譯成蛋白質，相關的實驗還在進行中
【圖文】：

(一)目的基因的獲得以pcDNA3.1一HBc一Hbs為模板進行PcR擴增，0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析見圖1一1，可見在1177bP左右有一條亮帶。ABCDEF2000bP1000帥750bP500bP1177bP200bPIOObP圖1一1.目的基因HBc一HbS的獲得Figl一1.PCRresultofHBc一HbsLaneA:DNAmarker(DL2000)，LaneB:controlLaneC一F:segme爪5ofHBc一Hbs(二)pGEM.T.RBc一Rbs陽性克隆的篩選純化上述PCR片段，克隆到pGEM一T載體上，轉化DHS。。挑取白斑，PCR方法鑒定陽性克隆，結果見圖1一2，可見1170bp處有一亮帶。

取陽性克隆抽提質粒，限制性內切酶BamH工和Sal工雙酶切，回收目的片段，克隆到植物表達載體pBIN438上，轉化DH5a。挑取數十個單克隆，PCR方法鑒定陽性克隆，結果見圖1一3。取2個PCR陽性克隆提取質粒，限制性內切酶BamHI和Sal工雙酶切，結果見圖1一4。
【學位授予單位】：第一軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2004
【分類號】：R392

【引證文獻】

相關碩士學位論文 前2條

1 方琳;豬傳染性胃腸炎病毒S1基因植物表達載體的構建及轉化番茄的研究[D];南京農業(yè)大學;2009年

2 鄭卿;抗Ⅰ型糖尿病基因轉化煙草、番茄的研究[D];揚州大學;2010年

本文編號：2656956