【摘要】：病毒性乙型肝炎是世界范圍內(nèi)一個(gè)嚴(yán)重的公眾健康及社會(huì)問(wèn)題，全世界約有4億HBV患者及病毒攜帶者，我國(guó)現(xiàn)HBV攜帶者約為1.2億人。以IFN-α為主的藥物治療效果并不理想，且費(fèi)用高、療程長(zhǎng)、停藥后易復(fù)發(fā)及長(zhǎng)期治療易產(chǎn)生耐藥性。目前最有效、最經(jīng)濟(jì)預(yù)防和控制HBV的措施是疫苗接種，但現(xiàn)在的HBV基因工程疫苗存在一定低應(yīng)答率問(wèn)題。當(dāng)務(wù)之急是研制一種有效、安全、經(jīng)濟(jì)、使用方便的新型疫苗。 植物基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展為新型疫苗的研究提供了新的解決方法。植物表達(dá)系統(tǒng)具有高效、價(jià)廉及使用方便等特點(diǎn)。已取得的成果和進(jìn)展表明，植物表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的抗原可保持自然免疫原性，口服后能夠誘發(fā)體液和粘膜免疫反應(yīng)。 由于pre-S1及pre-S2在HBV與肝細(xì)胞受體的粘附中起重要作用，而且在自然感染狀態(tài)下抗pre-S2抗體的產(chǎn)生要早于抗S抗體。pre-S1及pre-S2中存在的T細(xì)胞激活表位將有助于提高機(jī)體對(duì)S抗原的抗體反應(yīng)水平。因此包含pre-S1及pre-S2的HBV疫苗有助于克服機(jī)體對(duì)HBV的無(wú)應(yīng)答狀態(tài)。以HBc作為載體來(lái)表達(dá)高效疫苗已經(jīng)受到普遍認(rèn)可，其作為顆粒樣載體具有顯著的優(yōu)越性，可誘導(dǎo)較強(qiáng)的細(xì)胞及體液免疫應(yīng)答。 本研究通過(guò)以HBc為載體的HBV preS／S番茄疫苗的研究，探討HBV轉(zhuǎn)基因番茄作為口服疫苗的可行性，為HBV的預(yù)防探討一條新的途徑。先把preS／S基因插入到HBc的第73-94aa處(棘突尖部)，構(gòu)建了顆粒性表達(dá)載體HBc-Hbs；隨后將目的基因克隆到植物表達(dá)載體pBIN438上，液氮凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌eha105；用含pBIN438-HBc-Hbs的根癌農(nóng)桿菌侵染番茄2／3子葉和下胚軸；在MS_2培養(yǎng)基上培養(yǎng)大約35d，在愈傷組織處可見(jiàn)分化苗；待苗長(zhǎng)到3cm時(shí)，移到MS_3培養(yǎng)基上，根系發(fā)達(dá)后，，將完整的植株移栽到土壤中室溫生長(zhǎng)，共獲得67株抗性植株。 CTAB法提取植物總DNA，PCR方法鑒定外源HBc-Hbs基因(1177bp)，34株為陽(yáng)性�？紤]到PCR方法的假陽(yáng)性，進(jìn)行了PCR-southern 乙型肝炎病毒(HBV)顆粒性抗原轉(zhuǎn)基因番茄植株的構(gòu)建及鑒定 blot檢測(cè);為進(jìn)一步證明HBc一Hbs基因的整合情況，將植物總DNA BamHI 酶切過(guò)夜;同時(shí)設(shè)立經(jīng)相同酶切的重組質(zhì)粒pB水438一HBc一Hbs為陽(yáng)性對(duì) 照，以非轉(zhuǎn)化植株為陰性對(duì)照;根據(jù)顆粒性表達(dá)載體HBc一Hbs兩端序列 設(shè)計(jì)引物Pl和PZ，以質(zhì)粒pBIN438一HBc一Hbs為模板，用地高辛標(biāo)記探 針進(jìn)行Southem blot雜交分析;通過(guò)RT一PCR及Westen blot印跡雜交檢 測(cè)目的基因在番茄中的轉(zhuǎn)錄和翻譯情況。PCR、PCR一Southem blot、 Southem blot結(jié)果表明目的基因己整合到番茄的基因組中;RT一PCR、 Westem blot的結(jié)果證明目的基因已在番茄中轉(zhuǎn)錄為mRNA，并成功翻 譯成蛋白質(zhì)，相關(guān)的實(shí)驗(yàn)還在進(jìn)行中
【圖文】：

(一)目的基因的獲得以pcDNA3.1一HBc一Hbs為模板進(jìn)行PcR擴(kuò)增，0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析見(jiàn)圖1一1，可見(jiàn)在1177bP左右有一條亮帶。ABCDEF2000bP1000帥750bP500bP1177bP200bPIOObP圖1一1.目的基因HBc一HbS的獲得Figl一1.PCRresultofHBc一HbsLaneA:DNAmarker(DL2000)，LaneB:controlLaneC一F:segme爪5ofHBc一Hbs(二)pGEM.T.RBc一Rbs陽(yáng)性克隆的篩選純化上述PCR片段，克隆到pGEM一T載體上，轉(zhuǎn)化DHS。。挑取白斑，PCR方法鑒定陽(yáng)性克隆，結(jié)果見(jiàn)圖1一2，可見(jiàn)1170bp處有一亮帶。

取陽(yáng)性克隆抽提質(zhì)粒，限制性內(nèi)切酶BamH工和Sal工雙酶切，回收目的片段，克隆到植物表達(dá)載體pBIN438上，轉(zhuǎn)化DH5a。挑取數(shù)十個(gè)單克隆，PCR方法鑒定陽(yáng)性克隆，結(jié)果見(jiàn)圖1一3。取2個(gè)PCR陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒，限制性內(nèi)切酶BamHI和Sal工雙酶切，結(jié)果見(jiàn)圖1一4。
【學(xué)位授予單位】：第一軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號(hào)】：R392

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 方琳;豬傳染性胃腸炎病毒S1基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化番茄的研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

2 鄭卿;抗Ⅰ型糖尿病基因轉(zhuǎn)化煙草、番茄的研究[D];揚(yáng)州大學(xué);2010年

本文編號(hào)：2656956