發(fā)布時(shí)間：2020-05-07 00:52

【摘要】：TRAIL為Ⅱ型跨膜蛋白，屬于TNF家族分子。它可誘導(dǎo)某些敏感細(xì)胞的凋亡，包括腫瘤細(xì)胞與轉(zhuǎn)化細(xì)胞。盡管TRAIL與其它TNF家族分子如TNF-α、FasL等在結(jié)構(gòu)上存在同源性，但功能上卻有很大差異，主要表現(xiàn)在它選擇性誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞的凋亡卻保護(hù)大多數(shù)正常細(xì)胞免于受損，突破了TNF-α、FasL等分子在體內(nèi)應(yīng)用的局限性。 本研究構(gòu)建人TRAILcDNA的真核表達(dá)載體，對(duì)TRAIL分子的凋亡效應(yīng)進(jìn)行初步研究。 通過高保真聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法擴(kuò)增帶有人TRAIL114～281aa的基因片段。隨即將目的片段連入pGEX-6p-1，經(jīng)過酶切與測(cè)序證實(shí)擴(kuò)增得到的DNA的正確性。重組表達(dá)載體pGEX-6p-1-TRAIL在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，將表達(dá)產(chǎn)物免疫小鼠，制備多克隆抗血清。將經(jīng)過DNA序列測(cè)定后的人TRAILcDNA克隆進(jìn)真核表達(dá)載體pcDNA3，真核重組表達(dá)載體pcDNA3-TRAIL經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，間接免疫熒光檢測(cè)到人TRAIL在CHO細(xì)胞中的表達(dá)。采用MTT法和Annexin V-FITC法及流式細(xì)胞儀技術(shù)測(cè)定重組TRAIL對(duì)7402肝癌細(xì)胞的抑制活性。將7402肝癌組織移植于裸鼠皮下，建立裸鼠皮下腫瘤模型，構(gòu)建了真核表達(dá)載體pcDNA3-TRAIL，對(duì)建立的皮下腫瘤模型進(jìn)行治療。 DNA序列測(cè)定結(jié)果顯示：克隆的人TRAILcDNA與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，人TRAILcDNA可以在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。間接免疫熒光顯示轉(zhuǎn)染后的CHO細(xì)胞的胞漿內(nèi)有目的蛋白的表達(dá)。MTT和流式細(xì) 胞儀結(jié)果顯示重組TRAIL在體外可抑制7402肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，凋亡率可達(dá)31%， 治療結(jié)果顯示，克隆的人TRAILeDNA可以在小鼠體內(nèi)表達(dá)，達(dá)到抑制7402肝癌 細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)。本研究成功克隆并表達(dá)了人TRAIL，可以用來對(duì)裸鼠皮 下腫瘤模型進(jìn)行治療。
【圖文】：

TRAIL的受體示意圖

一一一一一一一一一一一進(jìn)巡塑巡蘭l2出置于一20℃�？寺〔呗砸妶D1。圖1:pGEx一印一1一TRAIL克隆策略1.5.3大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》所介紹的方法進(jìn)行，，簡(jiǎn)述步驟如下:從劃線培養(yǎng)的LB平板上挑取單個(gè)BLZI菌落，接種于5而LB培養(yǎng)基中，37℃搖震培養(yǎng)過夜，次日以1:100轉(zhuǎn)接種于lomlLB培養(yǎng)基中，37℃250印m培養(yǎng)2小時(shí)，將其置于冰水混合物中10分鐘，10O0rpm離心5分鐘;去上清
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號(hào)】：Q786

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 柳湘,田培坤,顧健人;聯(lián)合基因治療腫瘤研究新進(jìn)展[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(腫瘤學(xué)分冊(cè));2000年05期

2 方成,陳鈞輝;細(xì)胞凋亡與癌癥治療[J];中國(guó)生化藥物雜志;2000年06期

本文編號(hào)：2652145