【摘要】：目的：探討固定劑、固定時間及溫度對RNA病毒感染組織總RNA的完整性、得率及病毒RNA擴(kuò)增的影響。以及固定劑和固定時間對石蠟包埋組織中RNA降解和標(biāo)本病理形態(tài)學(xué)的影響。 方法：取漢坦病毒76—118株接種乳鼠的感染組織，以沉淀脫水類固定劑100％甲醇、75％乙醇、100％丙酮以及醛類固定劑4％的多聚甲醛磷酸緩沖液(4％PFA)、10％福爾馬林共五種固定劑，分別在4℃和室溫下固定病毒感染組織6h、12h、24h和48h后，對固定后標(biāo)本進(jìn)行如下檢測或處理：1、從固定6h～48h后的標(biāo)本中直接提取組織總RNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性；以分光光度計(jì)測吸光度計(jì)算組織總RNA得率；用巢式RT—PCR擴(kuò)增病毒RNA序列，電泳檢測PCR產(chǎn)物并行灰度掃描。對RNA得率及PCR產(chǎn)物電泳所測灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。2、將固定后的病毒感染組織標(biāo)本進(jìn)行石蠟包埋長期保存。對石蠟包埋組織切片后HE染色，鏡下觀察各種固定劑對組織病理形態(tài)學(xué)的影響。從長期保存的各種方式固定后石蠟包埋組織中以RT—PCR擴(kuò)增出不同片段長度的病毒RNA及β-actin RNA序列，以獲得產(chǎn)物最大長度或?qū)﹂L片段擴(kuò)增的可重復(fù)性及假陰性的多少，來反映各種固定方式對病毒RNA和細(xì)胞總RNA降解的影響。 結(jié)果：1、病理切片結(jié)果顯示，經(jīng)10％福爾馬林和4％PFA固定的石蠟切片，組織結(jié)構(gòu)完整清晰。其他三種沉淀脫水類固定劑固定后組織有不同程度收縮，但不影響組織病理形態(tài)學(xué)檢測，其中甲醇固定的收縮程度最小。 2、固定標(biāo)本直接提取RNA結(jié)果，(1)RNA完整性：與立即冰凍或新鮮組織比較，100％甲醇固定24h，RNA完整性損傷不明顯；75％乙醇、100％丙酮固定12h后RNA開始出現(xiàn)損傷帶，24h出現(xiàn)明顯的損傷；而10％福爾馬林、4％PFA固定6h就開始出現(xiàn)明顯的損傷，固定24 h幾乎很難看清RNA條帶。(2)RNA得率析因分析結(jié)果顯示，不同固定劑、固定時間、固定溫度下固定的組織中所提RNA的得率有顯著性差異(P＜0.01)，沉淀類固定劑固定后組織RNA得率明顯高于醛類固定劑(P＜0.01)； 三種沉淀類固定劑之間差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義伊0.01);4%PFA高于10%福爾馬林 (P0 .01)。固定劑、固定時間和固定溫度之間有顯著性交互作用(P0 .01)，4℃甲醇固 定6h的RNA得率最高，10%福爾馬林在室溫下固定48h得率最低。(3)固定后標(biāo) 本巢式RT一PCR，除10%的福爾馬林固定48h后擴(kuò)增結(jié)果不穩(wěn)定外，，其余各固定方式 均能擴(kuò)增出特異性帶。對電泳結(jié)果進(jìn)行灰度掃描時，甲醇、乙醇和丙酮固定的標(biāo)本中 擴(kuò)增的產(chǎn)物電泳條帶更亮，灰度值更高伊0 .01)。 3、從固定后石蠟包埋組織中提取RNA進(jìn)行RT一PCR擴(kuò)增時，擴(kuò)增的效果受固 定劑類型、固定時間及固定過程的溫度的影響，同時也受擴(kuò)增的基因片段長度的影響。 在可達(dá)到固定作用的前提下，同一固定劑固定時間越短，RT一PCR擴(kuò)增結(jié)果越穩(wěn)定。 采用相同的固定時間，從甲醇、乙醇及丙酮等沉淀類固定劑固定石蠟包埋的病毒組織 中擴(kuò)增出病毒RNA的陽性結(jié)果比醛類劑高，重復(fù)性好。尤其在在進(jìn)行長片段擴(kuò)增時， 假陰性現(xiàn)象比醛類固定劑固定的標(biāo)本少。各種沉淀固定劑之間無明顯區(qū)別。 結(jié)論:1、固定劑類型、固定溫度及固定持續(xù)時間的不同對病毒感染組織標(biāo)本的保 存產(chǎn)生明顯的影響。2、甲醇、75%乙醇及丙酮三種沉淀脫水類固定劑固定感染組織 后雖產(chǎn)生一定的收縮效應(yīng)，但不影響鏡下形態(tài)學(xué)的觀察。對核酸完整性的保存明顯優(yōu) 于醛類固定劑。與醛類固定劑相比，沉淀類的三種固定劑可保存分子量相對高的RNA。 3、RT一PCR從甲醇、丙酮及70%乙醇固定后保存的石蠟包埋組織中擴(kuò)增效果明顯優(yōu)于 甲醛類固定標(biāo)本。4、在臨床或流行病現(xiàn)場采樣時，可選用沉淀類固定劑，尤其推薦 用甲醇，以替換醛類固定劑。對病毒感染組織固定時間不宜偏長，固定過程的溫度宜 選用4℃。5、在對存檔的石蠟包埋組織作回顧性研究，解釋其PCR陰性結(jié)果時， 必需考慮組織標(biāo)本固定對RNA分子的影響。
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號】：R361

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前5條

1 帕提曼,曹俊,陳萬濤,張志愿;口腔鱗狀細(xì)胞癌高危型人乳頭狀瘤病毒感染的檢測[J];上海口腔醫(yī)學(xué);2000年04期

2 趙春芳,韓新軍,陳朝倫;HPV感染在新疆食管癌發(fā)生中的病理生物學(xué)意義[J];新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2001年04期

3 鄭文紅,張樂,程緒鵬;分子流行病學(xué)應(yīng)用于疾病研究進(jìn)展[J];現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生;2002年12期

4 史恩祥,沈喜,楊鳳蓮,李春光,姜靜;輸卵管妊娠與沙眼衣原體、解脲支原體及B19小病毒感染的關(guān)系研究[J];中國優(yōu)生與遺傳雜志;2001年05期

5 郎振為，閻惠平，李俊強(qiáng);聚合酶鏈反應(yīng)檢測乙型肝炎患者心肌組織中 HBV DNA[J];中華傳染病雜志;1994年01期

本文編號：2644863