【摘要】：目的：探討固定劑、固定時(shí)間及溫度對(duì)RNA病毒感染組織總RNA的完整性、得率及病毒RNA擴(kuò)增的影響。以及固定劑和固定時(shí)間對(duì)石蠟包埋組織中RNA降解和標(biāo)本病理形態(tài)學(xué)的影響。 方法：取漢坦病毒76—118株接種乳鼠的感染組織，以沉淀脫水類固定劑100％甲醇、75％乙醇、100％丙酮以及醛類固定劑4％的多聚甲醛磷酸緩沖液(4％PFA)、10％福爾馬林共五種固定劑，分別在4℃和室溫下固定病毒感染組織6h、12h、24h和48h后，對(duì)固定后標(biāo)本進(jìn)行如下檢測(cè)或處理：1、從固定6h～48h后的標(biāo)本中直接提取組織總RNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性；以分光光度計(jì)測(cè)吸光度計(jì)算組織總RNA得率；用巢式RT—PCR擴(kuò)增病毒RNA序列，電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物并行灰度掃描。對(duì)RNA得率及PCR產(chǎn)物電泳所測(cè)灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。2、將固定后的病毒感染組織標(biāo)本進(jìn)行石蠟包埋長(zhǎng)期保存。對(duì)石蠟包埋組織切片后HE染色，鏡下觀察各種固定劑對(duì)組織病理形態(tài)學(xué)的影響。從長(zhǎng)期保存的各種方式固定后石蠟包埋組織中以RT—PCR擴(kuò)增出不同片段長(zhǎng)度的病毒RNA及β-actin RNA序列，以獲得產(chǎn)物最大長(zhǎng)度或?qū)﹂L(zhǎng)片段擴(kuò)增的可重復(fù)性及假陰性的多少，來(lái)反映各種固定方式對(duì)病毒RNA和細(xì)胞總RNA降解的影響。 結(jié)果：1、病理切片結(jié)果顯示，經(jīng)10％福爾馬林和4％PFA固定的石蠟切片，組織結(jié)構(gòu)完整清晰。其他三種沉淀脫水類固定劑固定后組織有不同程度收縮，但不影響組織病理形態(tài)學(xué)檢測(cè)，其中甲醇固定的收縮程度最小。 2、固定標(biāo)本直接提取RNA結(jié)果，(1)RNA完整性：與立即冰凍或新鮮組織比較，100％甲醇固定24h，RNA完整性損傷不明顯；75％乙醇、100％丙酮固定12h后RNA開(kāi)始出現(xiàn)損傷帶，24h出現(xiàn)明顯的損傷；而10％福爾馬林、4％PFA固定6h就開(kāi)始出現(xiàn)明顯的損傷，固定24 h幾乎很難看清RNA條帶。(2)RNA得率析因分析結(jié)果顯示，不同固定劑、固定時(shí)間、固定溫度下固定的組織中所提RNA的得率有顯著性差異(P＜0.01)，沉淀類固定劑固定后組織RNA得率明顯高于醛類固定劑(P＜0.01)； 三種沉淀類固定劑之間差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義伊0.01);4%PFA高于10%福爾馬林 (P0 .01)。固定劑、固定時(shí)間和固定溫度之間有顯著性交互作用(P0 .01)，4℃甲醇固 定6h的RNA得率最高，10%福爾馬林在室溫下固定48h得率最低。(3)固定后標(biāo) 本巢式RT一PCR，除10%的福爾馬林固定48h后擴(kuò)增結(jié)果不穩(wěn)定外，，其余各固定方式 均能擴(kuò)增出特異性帶。對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行灰度掃描時(shí)，甲醇、乙醇和丙酮固定的標(biāo)本中 擴(kuò)增的產(chǎn)物電泳條帶更亮，灰度值更高伊0 .01)。 3、從固定后石蠟包埋組織中提取RNA進(jìn)行RT一PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增的效果受固 定劑類型、固定時(shí)間及固定過(guò)程的溫度的影響，同時(shí)也受擴(kuò)增的基因片段長(zhǎng)度的影響。 在可達(dá)到固定作用的前提下，同一固定劑固定時(shí)間越短，RT一PCR擴(kuò)增結(jié)果越穩(wěn)定。 采用相同的固定時(shí)間，從甲醇、乙醇及丙酮等沉淀類固定劑固定石蠟包埋的病毒組織 中擴(kuò)增出病毒RNA的陽(yáng)性結(jié)果比醛類劑高，重復(fù)性好。尤其在在進(jìn)行長(zhǎng)片段擴(kuò)增時(shí)， 假陰性現(xiàn)象比醛類固定劑固定的標(biāo)本少。各種沉淀固定劑之間無(wú)明顯區(qū)別。 結(jié)論:1、固定劑類型、固定溫度及固定持續(xù)時(shí)間的不同對(duì)病毒感染組織標(biāo)本的保 存產(chǎn)生明顯的影響。2、甲醇、75%乙醇及丙酮三種沉淀脫水類固定劑固定感染組織 后雖產(chǎn)生一定的收縮效應(yīng)，但不影響鏡下形態(tài)學(xué)的觀察。對(duì)核酸完整性的保存明顯優(yōu) 于醛類固定劑。與醛類固定劑相比，沉淀類的三種固定劑可保存分子量相對(duì)高的RNA。 3、RT一PCR從甲醇、丙酮及70%乙醇固定后保存的石蠟包埋組織中擴(kuò)增效果明顯優(yōu)于 甲醛類固定標(biāo)本。4、在臨床或流行病現(xiàn)場(chǎng)采樣時(shí)，可選用沉淀類固定劑，尤其推薦 用甲醇，以替換醛類固定劑。對(duì)病毒感染組織固定時(shí)間不宜偏長(zhǎng)，固定過(guò)程的溫度宜 選用4℃。5、在對(duì)存檔的石蠟包埋組織作回顧性研究，解釋其PCR陰性結(jié)果時(shí)， 必需考慮組織標(biāo)本固定對(duì)RNA分子的影響。
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號(hào)】：R361

【參考文獻(xiàn)】

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