【摘要】： 由蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs)和蛋白酪氨酸激酶(PTKs)共同動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)的可逆性蛋白酪氨酸磷酸化反應(yīng)在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、代謝、存活、細(xì)胞周期、細(xì)胞間相互聯(lián)系、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、基因轉(zhuǎn)錄、離子通道的活性、免疫應(yīng)答等多種重要生命活動(dòng)中具有重要作用。由于許多PTKs是癌基因和生長(zhǎng)因子受體，因此已得到了廣泛而深入的研究，但PTPs的重要性直到最近十幾年才得到充分的認(rèn)識(shí)。按照結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，PTPs被分為跨膜的受體型PTPs（R-PTPs）和可溶的胞漿型PTPs。前者又被分成七類，其中第II和III類R-PTPs的胞外區(qū)含免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域（Ig-like domain）和III型纖連蛋白樣結(jié)構(gòu)域（FN-III repeats），與細(xì)胞粘附分子的胞外區(qū)具有相似性，表明其有可能參與調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附。事實(shí)上，目前已證實(shí)PTPμ，PTPκ可通過其胞外區(qū)的同源性結(jié)合介導(dǎo)細(xì)胞粘附。 本課題研究的PCP-2是王紅陽(yáng)教授等于1996年在胰腺癌細(xì)胞株中克隆并鑒定的一個(gè)R-PTPs家族的新成員，cDNA全長(zhǎng)5581 bp，編碼一個(gè)含1430個(gè)氨基酸的具有磷酸酶活性的蛋白，與PTPμ，PTPκ具有較高的同源性，屬于IIB型R-PTPs。其胞內(nèi)區(qū)含兩個(gè)磷酸酶結(jié)構(gòu)域和一個(gè)相對(duì)較長(zhǎng)的近膜區(qū)，該區(qū)與cadherins保守的胞內(nèi)區(qū)具有一定的同源性，是cadherins與catenins相互作用所必需的，cadherins通過catenins的作用而與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架作用，參與對(duì)細(xì)胞粘附的調(diào)節(jié)。越來(lái)越多的證據(jù)表明可逆的酪氨酸磷酸化是調(diào)節(jié)cadherins-catenins復(fù)合體的粘附功能的重要機(jī)制。到目前為止，對(duì)PCP-2的進(jìn)一步研究的報(bào)道很少，關(guān)于PCP-2與catenins的相互作用以及PCP-2對(duì)細(xì)胞粘附遷移能力的影響還未見報(bào)道。 WP=5 本研究課題旨在通過應(yīng)用Western Blot、Northern Blot、免疫共沉淀、定點(diǎn)突變和缺失突變、基因轉(zhuǎn)染等技術(shù)，研究PCP-2在真核細(xì)胞中的表達(dá)，比較PCP-2與PTPκ、PTPμ等同類分子在表達(dá)上的差別。然后從mRNA和蛋白表達(dá)水平研究PCP-2表達(dá)水平與細(xì)胞密度的關(guān)系，初步探討PCP-2對(duì)細(xì)胞接觸聚集的影響。繼之，采用基因轉(zhuǎn)染和免疫共沉淀技術(shù)研究PCP-2與β-catenin在細(xì)胞中的相互作用。明確二者可直接結(jié)合后，通過獲得PCP-2的EXT 、(C1C2 、(C2等一系列缺失突變體分析二者作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，通過構(gòu)建PCP-2兩個(gè)磷酸酶結(jié)構(gòu)域的定點(diǎn)突變體分析PCP-2對(duì)β-catenin的去磷酸化作用，進(jìn)一步推理PCP-2與β-catenin相互作用的可能機(jī)制，為深入研究PCP-2對(duì)細(xì)胞粘附遷移能力的影響提供線索。最后采用Western Blot技術(shù)篩選一個(gè)PCP-2表達(dá)缺失的細(xì)胞系，直接觀察PCP-2轉(zhuǎn)染該細(xì)胞系后對(duì)細(xì)胞粘附遷移能力的影響。 本實(shí)驗(yàn)室采用Western Blot 技術(shù)分析PCP-2在真核細(xì)胞中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在內(nèi)源性表達(dá)PCP-2的WRL68細(xì)胞和外源性表達(dá)PCP-2的COS-7細(xì)胞中均只檢測(cè)到一個(gè)大小約為180 KDa的特異蛋白帶，無(wú)任何水解的蛋白片段，與PTPκ，PTPμ等同類分子具有顯著差異。 采用Northern Blot和Western Blot 分析PCP-2的表達(dá)水平與細(xì)胞密度的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)PCP-2在mRNA和蛋白水平的表達(dá)均隨著WRL68細(xì)胞的密度增加而上升。100 %匯合率的WRL68細(xì)胞的PCP-2 mRNA表達(dá)水平是30 %匯合率細(xì)胞的3倍,而蛋白表達(dá)水平則上升至5.5倍，上升幅度明顯高于mRNA 水平。提示PCP-2的表達(dá)受轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平共同調(diào)控，可能具有調(diào)節(jié)和穩(wěn)定細(xì)胞-細(xì)胞連接的作用。 通過表達(dá)并純化六組氨酸融合的β-catenin C-端融合蛋白，免疫新西蘭大白兔獲得抗β-catenin C-端的多克隆抗體。鑒定顯示：該抗體適用于Western Blot和免疫沉淀技術(shù)，效價(jià)約為1：500。為進(jìn)一步研究PCP-2與β-catenin的相互作用提供了有效工具。運(yùn)用基因轉(zhuǎn)染和免疫共沉淀技術(shù)研究PCP-2與β-catenin的相互作用，證實(shí)PCP-2與β-catenin可直接結(jié)合，而且經(jīng)過將PCP-2、β-catenin和/或SrcY527F共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，或者用EGF刺激共轉(zhuǎn)染了PCP-2 和β-catenin的BHK-21細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)PCP-2與β-catenin的結(jié)合與β-catenin的磷酸化狀態(tài)無(wú)關(guān)。通過限制性內(nèi)切酶酶切或PCR技術(shù)獲得PCP-2的一系列缺失突變體 WP=6 PCP-2 EXT， PCP-2 ?C1C2和PCP-2 ?C2，采用基因轉(zhuǎn)染和免疫共沉淀技術(shù)，明確了PCP-2的近膜區(qū)是PCP-2與β-catenin相互作用所必需的。采用mega-primer方法獲得PCP-2兩個(gè)磷酸酶結(jié)構(gòu)域的核心氨基酸Cys的定點(diǎn)突變體PCP-2 C1069S，PCP-2 C1364S，與β-catenin和/或SrcY527F共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，結(jié)果顯示PCP-2可使β-catenin去磷酸化，而且N-端近膜的磷酸酶結(jié)構(gòu)域具有大部分或全部磷酸酶活性，C端的磷酸酶結(jié)構(gòu)域幾乎沒有或者只有很少的磷酸酶活性。提示：β- catenin是PCP-2的一個(gè)底物。 用Western Blot篩選到PCP-2表達(dá)缺失的BHK-21細(xì)胞，采用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將PCP-2基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至BHK-21后發(fā)現(xiàn)：PCP-2基因轉(zhuǎn)染抑制BHK-21細(xì)胞的遷移能力，選擇性促進(jìn)BHK-21細(xì)胞對(duì)特異性粘附底物的粘附作用。 本研究結(jié)果表明：PCP-2在真核細(xì)胞中只表達(dá)一個(gè)蛋白，而無(wú)水解片段，PCP-2表達(dá)水平隨著細(xì)胞密度增加而上升。PCP-2通過其近膜區(qū)與β-catenin結(jié)合而相互作用，使β-catenin去磷酸化。生物學(xué)研究顯示PCP-2能抑制細(xì)胞遷移，促進(jìn)細(xì)胞的粘附能力。
【圖文】：

.3.1. 構(gòu) 建 PCP-2 胞 內(nèi) 區(qū) 各 結(jié) 構(gòu) 域 的 缺 失 突 變 體 取 抽 提K5RS-PCP-2 質(zhì)粒和 pBSK 質(zhì)粒各 4 μg，，用 XbaI 和 HindIII 雙酶切，回收酶得的大小約 5.58 kb (PCP-2)和 2.98 kb(雙酶切后完全線性化的 pBSK)的片段酶切所得的 PCP-2 cDNA 和 pBSK 片段用 T4 連接酶于 22 °C 連接 1 h。連接轉(zhuǎn)化宿主菌 XL1-Blue,如前所述鑒定出正確的 pBSK-PCP-2 克隆(以aI+HindIII 酶切觀察到 2.98 kb 和 5.58 kb 兩條帶為正確)。該質(zhì)粒的限制性位點(diǎn)分布如圖 1 所示。

PCP-2點(diǎn)突變體相對(duì)位置示意圖
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2002
【分類號(hào)】：Q55

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2643608