【摘要】： 抗凝血酶Ⅲ(antithrombinⅢ，AT—Ⅲ)是一種抗凝血糖蛋白，對維持血凝平衡起重要作用，其缺乏易導致血栓形成。血漿中提取的AT—Ⅲ濃縮物廣泛應用于臨床。但是，在愛滋病、肝炎等血液傳播性疾病肆虐的今天，血液制品的安全性成為人們關注的重要問題。所以，利用基因工程的方法表達人重組抗凝血酶Ⅲ已成為一種發(fā)展趨勢。 本課題用巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)表達系統(tǒng)對AT—Ⅲ基因進行表達。具體內容包括下面幾部分：(1)載體的構建。利用計算機程序進行引物設計，由真核細胞載體pcDNA3.1—ATⅢ中擴增AT—Ⅲ基因，兩種引物設計使重組AT-Ⅲ信號肽分別采用兩種形式：宿主的信號肽和AT—Ⅲ天然信號肽。擴增的AT—Ⅲ cDNA測序正確后，裝入pPIC9K，構建重組表達載體pPIC9K-AT。(2)轉化和表達。將構建好的載體利用電穿孔儀轉入巴斯德畢赤酵母中表達，測活。利用SDS-PAGE及Western blot鑒定。結果表明，表達活性良好。并對表達培養(yǎng)基的條件進行了優(yōu)化。(3)純化。將發(fā)酵液離心，上清經0.22μm膜過濾，采用親和層析法(肝素親和層析柱)，將產物初步純化，產物純度可達95％以上。(4)AT-Ⅲ的DNA改組研究。將AT-Ⅲ基因以DNAase Ⅰ部分酶解，經無引物和有引物兩步PCR擴增，形成與原基因大小相似的改組基因庫，再轉入畢赤酵母中表達，篩選高表達株，已篩到15株。所以，我們成功地在巴斯德畢赤酵母中表達了AT-Ⅲ，，并對其進行了DNA改組的初步研究。
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2003
【分類號】：R346

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