【摘要】： 背景與目的： 隨著近年來對于干細(xì)胞研究的不斷深入發(fā)展和新的研究工具、實驗技術(shù)的涌現(xiàn)，對于精原干細(xì)胞（Spermatogonial stem cell,SSC）的研究亦激起人們的濃厚興趣。目前雖然對某些種屬動物如大鼠、小鼠、豬、牛等的SSC細(xì)胞已進(jìn)行初步分離、培養(yǎng)和移植的研究，并且在SSC的體外培養(yǎng)研究方面，通過對不同種屬精原細(xì)胞培養(yǎng)條件的不斷摸索，應(yīng)用不同成分的培養(yǎng)基如DMEM、DMEM/F12、無血清培養(yǎng)基、富含鉀離子的KSOM培養(yǎng)基等，已建立了多種不同培養(yǎng)系統(tǒng)，如以Sertoli細(xì)胞作為飼養(yǎng)層的共同培養(yǎng)體系、以STO（小鼠胚胎成纖維細(xì)胞無限系）作為飼養(yǎng)層的生殖細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)等。但是SSC作為復(fù)雜的精子發(fā)生過程的基礎(chǔ)和前提，其生化和分子特性以及增殖、分化的生物學(xué)詳細(xì)機(jī)理尚缺乏深入研究，對人SSC體外培養(yǎng)等的研究則更少。隨著對各類干細(xì)胞研究手段的日益發(fā)展，進(jìn)行人類和動物睪丸精原細(xì)胞的純化分離、培養(yǎng)以及誘導(dǎo)分化是本領(lǐng)域研究的迫切需求。 針對目前睪丸SSC細(xì)胞的研究現(xiàn)狀，本課題通過應(yīng)用正常人胎兒睪丸組織分離純化獲得較高純度的人SSC，然后選擇不同的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)，從而尋求人SSC體外長期培養(yǎng)的優(yōu)化培養(yǎng)體系，并為進(jìn)一步行人SSC移植和功能鑒定奠定基礎(chǔ)。本研究分三步進(jìn)行：1.進(jìn)行飼養(yǎng)層制備：制備不同的飼養(yǎng)層包括小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF）飼養(yǎng)層、小鼠胚胎成纖維細(xì)胞無限系（STO）飼養(yǎng)層以備用于精原細(xì)胞的培養(yǎng)；2.人睪丸SSC的分離和純化：采用聯(lián)合二步酶法消化、Percoll密度梯度離心、差異粘附等分離和純化步驟獲得成活率良好，含量較高的人睪丸精原細(xì)胞；3.培養(yǎng)條件的優(yōu)化及精原細(xì)胞的長期培養(yǎng)觀察：選擇不同的培養(yǎng)介質(zhì)DMEM、DMEM/F12、無血清培養(yǎng)基等在不同的共培養(yǎng)體系中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和觀察，并選擇可使人SSC在體外穩(wěn)定存活的培養(yǎng)體系進(jìn)行了長期培養(yǎng)觀察。 方法： 實驗細(xì)胞來自正常人睪丸組織（取自妊娠6個月以上合法引產(chǎn)胎兒）。應(yīng)用聯(lián)合酶消化法對睪丸組織進(jìn)行消化，獲得的單細(xì)胞懸液應(yīng)用Percoll不連續(xù)密度梯度離心和差異粘附等方法進(jìn)一步分離純化得到人精原細(xì)胞，然后分別以Sertoli細(xì)胞、STO細(xì)胞、MEF作為飼養(yǎng)層并接種在DMEM、DMEM/F12、DMEM-SF三種培養(yǎng)基中進(jìn)行體外培養(yǎng)。通過光鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和檢測，對短期培養(yǎng)條件下各組存活精原細(xì)胞的比例進(jìn)行統(tǒng)計分析，對共同培養(yǎng)體系進(jìn)行了長期培養(yǎng)觀察，并用免疫組化方法對精原細(xì) WP=8 胞所表達(dá)的抗原蛋白SSEA-1進(jìn)行了初步檢測。 結(jié)果： 1、用12.5dpc的小鼠胚胎制備MEF，培養(yǎng)后，細(xì)胞的貼壁率較高，增殖快，細(xì)胞活率好。 2、經(jīng)過兩步酶消化后獲得的睪丸細(xì)胞進(jìn)行臺盼藍(lán)拒染（排斥）試驗觀察活細(xì)胞數(shù)顯示，平均活細(xì)胞及死細(xì)胞百分率分別為89.71%、10.29%。 3、Percoll不連續(xù)密度梯度離心和差異粘附等方法可以有效的對人精原細(xì)胞進(jìn)行分離純化，其中精原細(xì)胞主要分布于27%~ 35%（密度為1.0410g/ml~1.0508g/ml）的梯度之間。此帶中精原細(xì)胞的純度平均達(dá)到60.42%。 4、以DMEM-SF作為培養(yǎng)基的三種不同的共培養(yǎng)體系在經(jīng)過3天的培養(yǎng)后，精原細(xì)胞所占比例有非常顯著的減少。而以DMEM/F12作為培養(yǎng)基的三種不同的共培養(yǎng)體系在經(jīng)過3天的培養(yǎng)后，顯示和Sertoli細(xì)胞共培養(yǎng)的體系中精原細(xì)胞所占比例最高，顯著高于以STO細(xì)胞或MEF作為飼養(yǎng)層的培養(yǎng)體系。 5、精原細(xì)胞在與支持細(xì)胞的共培養(yǎng)體系中可以長期存活，形態(tài)學(xué)特征表現(xiàn)為附著于支持細(xì)胞表面直徑為18-24μm的圓形、橢圓形或具有突起的梭形扁平細(xì)胞，，隨培養(yǎng)時間的延長精原細(xì)胞在共同培養(yǎng)體系中相對數(shù)量有所減少，但可長期生存并擴(kuò)增。 6、經(jīng)Percoll分離后的精原細(xì)胞顯示大部分呈SSEA-1陽性染色，表現(xiàn)為細(xì)胞呈棕黃色深染。經(jīng)過3周體外培養(yǎng)后所獲得的細(xì)胞經(jīng)SSEA-1免疫染色，結(jié)果顯示仍有多量細(xì)胞存在明顯陽性染色。 結(jié)論： 1、應(yīng)用聯(lián)合酶消化法、Percoll不連續(xù)密度梯度離心和差異粘附等方法可以有效的對人精原細(xì)胞進(jìn)行分離純化。 2、人精原細(xì)胞的長期體外培養(yǎng)依賴于適當(dāng)?shù)娘曫B(yǎng)層細(xì)胞的存在，而且精原細(xì)胞在與Sertoli細(xì)胞共同培養(yǎng)體系中能夠較好的長期體外生存并擴(kuò)增。 3、人胎兒精原細(xì)胞可表達(dá)SSEA-1抗原，而且經(jīng)過長期培養(yǎng)后仍可以觀察到持續(xù)表達(dá)SSEA-1的精原細(xì)胞。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號】：R329

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本文編號：2640250