【摘要】： 瘧疾是廣泛流行于熱帶、亞熱帶及溫帶邊緣的一種重要蟲媒傳染病，極大地威脅著人類的健康。瘧疾的早期診斷和早期正規(guī)治療是WHO和我國瘧疾控制的研究重點，其意義在于不僅能夠降低重癥病人和死亡的發(fā)生，還能防止其傳播，延緩瘧原蟲對抗瘧藥產(chǎn)生抗性。瘧疾流行區(qū)由于熟練鏡檢技術(shù)人員及設(shè)備缺乏，僅依靠傳統(tǒng)厚薄血膜鏡檢法已越來越不能適應(yīng)當(dāng)前瘧疾診斷的需要。八十年代以來隨著分子生物學(xué)的發(fā)展而出現(xiàn)的基因診斷技術(shù)(分子雜交，PCR、套式PCR、熒光定量PCR等)，顯示了較高的敏感性和特異性，可以對瘧原蟲的感染作出早期快速診斷，但需要更復(fù)雜的儀器設(shè)備和技術(shù)條件作為支持，難以在基層推廣應(yīng)用。近年來以檢測瘧原蟲合成并分泌的特異性抗原為基礎(chǔ)的免疫學(xué)方法，尤其是以單抗為基礎(chǔ)的Dipstick技術(shù)，由于其操作簡便、快速，結(jié)果易于判定，已成為瘧疾診斷研究的發(fā)展方向。目前瘧原蟲相對特異的富組氨酸蛋白Ⅱ(HRPⅡ)和乳酸脫氫酶(LDH)正被應(yīng)用于瘧疾的診斷，現(xiàn)場評估顯示出了較好的效果。 近年來研究揭示，瘧原蟲GDH同脊椎動物組織的GDH在理化、生物學(xué)特性及酶學(xué)方面有較大差異，如瘧原蟲GDH活性不受嘌呤核苷酸(GTP、ADP)的影響，而脊椎動物組織的GDH可被GTP、ADP激活或抑制；瘧原蟲GDH特異地以輔酶Ⅱ為其輔酶，而脊椎動物組織的GDH可以輔酶Ⅰ或Ⅱ作為輔酶。臨床和實驗研究證據(jù)表明，瘧原蟲比其宿主細胞更易受氧化壓力影響，因此參與巰基代謝及參與還原型輔酶Ⅱ(NADPH)再生的脫氫酶對于瘧原蟲免受宿主體內(nèi)氧化劑損傷及維持生存起著極其重要的作用。瘧原蟲GDH被認為是NADPH生成的主要來源，而且更為重要的是，宿主紅細胞內(nèi)沒有此酶(GDH—NADP~+)。另外， 李林海：惡付瘧原蟲谷氨酸脫氫酶基因的克隆、表達及產(chǎn)物抗原活性研究 免疫學(xué)研究初步表明瘧原蟲GDH可能具有一定的種、屬特異性。近兩年 有人通過在瘧疾感染者血漿和瘧原蟲培養(yǎng)上清中利用變形桿菌GDH交 叉抗體檢測該抗原或測定該酶活性來診斷惡性瘧原蟲感染，取得了較滿 意的結(jié)果，提示該酶有望成為一種瘧疾新型診斷分子。同時，，由于瘧原 蟲GDH也僅山活蟲體產(chǎn)生，血液中GDHp的水平與蟲體血癥呈平行相 關(guān)，因此還可用之來監(jiān)測感染過程和抗瘧藥物的治療效果。 本研究利用PCR技術(shù)釣取了惡性瘧原蟲海南株OCC／n們谷氨酸脫 氫酶編碼基因，克隆入pGEX－4T＊表達載體，測定的序列與惡性瘧原蟲 Thailand株GDH基因序列進行比較，其推導(dǎo)的氨基酸序列與不同物種的 GDH序列進行同源性分析，以探討惡性瘧原蟲谷氨酸脫氫酶（GDHpfl獨 特的理化、生物學(xué)及酶學(xué)特性的分于機制。并在大腸桿菌 BLZI中進行 了誘導(dǎo)表達，純化重組蛋白免疫小鼠制備多克隆抗體，運用ELISA、 Western．blot進行抗原性分析，為下一步篩選單抗用于GDH免疫膠體金 診斷試劑仰ICA）盒的研制奠定基礎(chǔ)。 結(jié)果顯示，利用PCR技術(shù)成功地釣取了編碼我國惡性瘧原蟲海南株 oCC lffl：N）谷氨酸脫氫酶的基因序列。將GDHpf基因克隆到pG職－4T上 表達質(zhì)粒，經(jīng)PCR、限制性酶切分析等鑒定，構(gòu)建了PGEX－GDH重組 表達質(zhì)粒，首次測定了編碼我國惡性瘧原蟲海南株歷CC l／HN）谷氨酸脫 氫酶編碼基因的全序列，大小為1413hp，無內(nèi)含子。惡性瘧原蟲海南株 GDH基因與Thailand株GDH基因相比，兩者同源性高達99．86O，僅存 在2個點突變，且均為同義突變，兩者推導(dǎo)的氨基酸序列完全相同，說 明該基因在不同的惡性瘧原蟲株之間高度保守。同源性分析結(jié)果表明， 惡性瘧原蟲海南株GDH氨基酸序列與人的GDH同工酶、藍氏賈第鞭毛 蟲、克魯氏錐蟲和細菌GDH相比，同源性較低，即使與BLAST檢索出 的具有最高同源性的藍氏賈第鞭毛蟲相比，也僅有57．90％的氨基酸殘基 相同，因此，瘧原蟲GDH明顯不同于其它生物GDH。 重組質(zhì)粒在大腸桿菌中表達出GDHpf與谷瞇甘肽S－轉(zhuǎn)移酶（GST）的 融合蛋白，表達產(chǎn)物主要以包涵體形式存在，重組蛋白分子量約為 66KDa，表達量約占菌體總蛋白的 13石％，用鼠抗惡性瘧原蟲免疫血清 對表達產(chǎn)物進行Western－blot分析，發(fā)現(xiàn)特異性區(qū)帶出現(xiàn)在66kDa處， 表明該蛋白確實是所要表達的GST融合蛋白。進一步用制備電泳法純化 －3－ 第一軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文 的表達產(chǎn)物免疫小鼠制備免疫血清，ELISA和Western七＊ 分析表明該 兔疫血清能與惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲49ica處的蟲源蛋白起反應(yīng)，而 與剛地弓形蟲、日本血吸蟲及未感染的紅細胞不發(fā)生交叉反應(yīng)，說明重 組蛋臼中包含有所需的抗原表位且具有良好的抗原活性。這就為下一步 篩選單抗用于GDH免疫膠體金診斷試劑（GICA）盒的研制奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

一、GDHPf基因的擴增用Pl和PZ兩條引物擴增惡性瘧原蟲FCCI/HN株GDH基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳顯示，在約1430bP處有一特異擴增條帶(圖1一l)，分子量大小與已報道的惡性瘧原蟲Thailand株GDH一致[4‘]。15001000圖1一1.惡性瘧原蟲基因組PCR擴增結(jié)果M.分子量標準(DNAladder);1，2.PcR產(chǎn)物;3.陰性對照Figl一1.TheresultofthegenomieDNAofP.falciParumbyPCRM.Marker(DNAladder);l，2.PCRProduets;3.Negativeeontrol二、重組克隆的篩選及鑒定PCR產(chǎn)物經(jīng)酚一氯仿抽提，乙醇沉淀后用Ec口R卜Sall進行雙酶切，載體pGEx一4T一1經(jīng)EcoR卜sall雙酶切后回收大片段，將PcR擴增后的酶切回收產(chǎn)物定向連接到載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TGI。從轉(zhuǎn)化平板上挑取9個單菌落

UnrecombinantPlasmids:2一6.ReeombinantPlasmids唱500卻圖1一pGEx一GDH重組質(zhì)粒的PcR鑒定M.分子量標準(DNAladder);1.PcR產(chǎn)物;2.pGEX礴T一1擴增產(chǎn)物;3一又pGEx一ooH擴增產(chǎn)物Figl一3.Iden朋eationofreeombinantPGEX一GDHPlasmidbyPCRM.Marker(DNAladder);1.Productsal刀PlifiedfromgenomieDNA之ProduetsamPlifiedfromPGEX-4T一13一7.ProduetsamPlifiedfromPGEX一GDH
【學(xué)位授予單位】：第一軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2002
【分類號】：R392

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6 陳f

本文編號：2639079