【摘要】： 瘧疾是廣泛流行于熱帶、亞熱帶及溫帶邊緣的一種重要蟲(chóng)媒傳染病，極大地威脅著人類的健康。瘧疾的早期診斷和早期正規(guī)治療是WHO和我國(guó)瘧疾控制的研究重點(diǎn)，其意義在于不僅能夠降低重癥病人和死亡的發(fā)生，還能防止其傳播，延緩瘧原蟲(chóng)對(duì)抗瘧藥產(chǎn)生抗性。瘧疾流行區(qū)由于熟練鏡檢技術(shù)人員及設(shè)備缺乏，僅依靠傳統(tǒng)厚薄血膜鏡檢法已越來(lái)越不能適應(yīng)當(dāng)前瘧疾診斷的需要。八十年代以來(lái)隨著分子生物學(xué)的發(fā)展而出現(xiàn)的基因診斷技術(shù)(分子雜交，PCR、套式PCR、熒光定量PCR等)，顯示了較高的敏感性和特異性，可以對(duì)瘧原蟲(chóng)的感染作出早期快速診斷，但需要更復(fù)雜的儀器設(shè)備和技術(shù)條件作為支持，難以在基層推廣應(yīng)用。近年來(lái)以檢測(cè)瘧原蟲(chóng)合成并分泌的特異性抗原為基礎(chǔ)的免疫學(xué)方法，尤其是以單抗為基礎(chǔ)的Dipstick技術(shù)，由于其操作簡(jiǎn)便、快速，結(jié)果易于判定，已成為瘧疾診斷研究的發(fā)展方向。目前瘧原蟲(chóng)相對(duì)特異的富組氨酸蛋白Ⅱ(HRPⅡ)和乳酸脫氫酶(LDH)正被應(yīng)用于瘧疾的診斷，現(xiàn)場(chǎng)評(píng)估顯示出了較好的效果。 近年來(lái)研究揭示，瘧原蟲(chóng)GDH同脊椎動(dòng)物組織的GDH在理化、生物學(xué)特性及酶學(xué)方面有較大差異，如瘧原蟲(chóng)GDH活性不受嘌呤核苷酸(GTP、ADP)的影響，而脊椎動(dòng)物組織的GDH可被GTP、ADP激活或抑制；瘧原蟲(chóng)GDH特異地以輔酶Ⅱ?yàn)槠漭o酶，而脊椎動(dòng)物組織的GDH可以輔酶Ⅰ或Ⅱ作為輔酶。臨床和實(shí)驗(yàn)研究證據(jù)表明，瘧原蟲(chóng)比其宿主細(xì)胞更易受氧化壓力影響，因此參與巰基代謝及參與還原型輔酶Ⅱ(NADPH)再生的脫氫酶對(duì)于瘧原蟲(chóng)免受宿主體內(nèi)氧化劑損傷及維持生存起著極其重要的作用。瘧原蟲(chóng)GDH被認(rèn)為是NADPH生成的主要來(lái)源，而且更為重要的是，宿主紅細(xì)胞內(nèi)沒(méi)有此酶(GDH—NADP~+)。另外， 李林海：惡付瘧原蟲(chóng)谷氨酸脫氫酶基因的克隆、表達(dá)及產(chǎn)物抗原活性研究 免疫學(xué)研究初步表明瘧原蟲(chóng)GDH可能具有一定的種、屬特異性。近兩年 有人通過(guò)在瘧疾感染者血漿和瘧原蟲(chóng)培養(yǎng)上清中利用變形桿菌GDH交 叉抗體檢測(cè)該抗原或測(cè)定該酶活性來(lái)診斷惡性瘧原蟲(chóng)感染，取得了較滿 意的結(jié)果，提示該酶有望成為一種瘧疾新型診斷分子。同時(shí)，，由于瘧原 蟲(chóng)GDH也僅山活蟲(chóng)體產(chǎn)生，血液中GDHp的水平與蟲(chóng)體血癥呈平行相 關(guān)，因此還可用之來(lái)監(jiān)測(cè)感染過(guò)程和抗瘧藥物的治療效果。 本研究利用PCR技術(shù)釣取了惡性瘧原蟲(chóng)海南株OCC／n們谷氨酸脫 氫酶編碼基因，克隆入pGEX－4T＊表達(dá)載體，測(cè)定的序列與惡性瘧原蟲(chóng) Thailand株GDH基因序列進(jìn)行比較，其推導(dǎo)的氨基酸序列與不同物種的 GDH序列進(jìn)行同源性分析，以探討惡性瘧原蟲(chóng)谷氨酸脫氫酶（GDHpfl獨(dú) 特的理化、生物學(xué)及酶學(xué)特性的分于機(jī)制。并在大腸桿菌 BLZI中進(jìn)行 了誘導(dǎo)表達(dá)，純化重組蛋白免疫小鼠制備多克隆抗體，運(yùn)用ELISA、 Western．blot進(jìn)行抗原性分析，為下一步篩選單抗用于GDH免疫膠體金 診斷試劑仰ICA）盒的研制奠定基礎(chǔ)。 結(jié)果顯示，利用PCR技術(shù)成功地釣取了編碼我國(guó)惡性瘧原蟲(chóng)海南株 oCC lffl：N）谷氨酸脫氫酶的基因序列。將GDHpf基因克隆到pG職－4T上 表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)PCR、限制性酶切分析等鑒定，構(gòu)建了PGEX－GDH重組 表達(dá)質(zhì)粒，首次測(cè)定了編碼我國(guó)惡性瘧原蟲(chóng)海南株歷CC l／HN）谷氨酸脫 氫酶編碼基因的全序列，大小為1413hp，無(wú)內(nèi)含子。惡性瘧原蟲(chóng)海南株 GDH基因與Thailand株GDH基因相比，兩者同源性高達(dá)99．86O，僅存 在2個(gè)點(diǎn)突變，且均為同義突變，兩者推導(dǎo)的氨基酸序列完全相同，說(shuō) 明該基因在不同的惡性瘧原蟲(chóng)株之間高度保守。同源性分析結(jié)果表明， 惡性瘧原蟲(chóng)海南株GDH氨基酸序列與人的GDH同工酶、藍(lán)氏賈第鞭毛 蟲(chóng)、克魯氏錐蟲(chóng)和細(xì)菌GDH相比，同源性較低，即使與BLAST檢索出 的具有最高同源性的藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)相比，也僅有57．90％的氨基酸殘基 相同，因此，瘧原蟲(chóng)GDH明顯不同于其它生物GDH。 重組質(zhì)粒在大腸桿菌中表達(dá)出GDHpf與谷瞇甘肽S－轉(zhuǎn)移酶（GST）的 融合蛋白，表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體形式存在，重組蛋白分子量約為 66KDa，表達(dá)量約占菌體總蛋白的 13石％，用鼠抗惡性瘧原蟲(chóng)免疫血清 對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Western－blot分析，發(fā)現(xiàn)特異性區(qū)帶出現(xiàn)在66kDa處， 表明該蛋白確實(shí)是所要表達(dá)的GST融合蛋白。進(jìn)一步用制備電泳法純化 －3－ 第一軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文 的表達(dá)產(chǎn)物免疫小鼠制備免疫血清，ELISA和Western七＊ 分析表明該 兔疫血清能與惡性瘧原蟲(chóng)和間日瘧原蟲(chóng)49ica處的蟲(chóng)源蛋白起反應(yīng)，而 與剛地弓形蟲(chóng)、日本血吸蟲(chóng)及未感染的紅細(xì)胞不發(fā)生交叉反應(yīng)，說(shuō)明重 組蛋臼中包含有所需的抗原表位且具有良好的抗原活性。這就為下一步 篩選單抗用于GDH免疫膠體金診斷試劑（GICA）盒的研制奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

一、GDHPf基因的擴(kuò)增用Pl和PZ兩條引物擴(kuò)增惡性瘧原蟲(chóng)FCCI/HN株GDH基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳顯示，在約1430bP處有一特異擴(kuò)增條帶(圖1一l)，分子量大小與已報(bào)道的惡性瘧原蟲(chóng)Thailand株GDH一致[4‘]。15001000圖1一1.惡性瘧原蟲(chóng)基因組PCR擴(kuò)增結(jié)果M.分子量標(biāo)準(zhǔn)(DNAladder);1，2.PcR產(chǎn)物;3.陰性對(duì)照Figl一1.TheresultofthegenomieDNAofP.falciParumbyPCRM.Marker(DNAladder);l，2.PCRProduets;3.Negativeeontrol二、重組克隆的篩選及鑒定PCR產(chǎn)物經(jīng)酚一氯仿抽提，乙醇沉淀后用Ec口R卜Sall進(jìn)行雙酶切，載體pGEx一4T一1經(jīng)EcoR卜sall雙酶切后回收大片段，將PcR擴(kuò)增后的酶切回收產(chǎn)物定向連接到載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TGI。從轉(zhuǎn)化平板上挑取9個(gè)單菌落

UnrecombinantPlasmids:2一6.ReeombinantPlasmids唱500卻圖1一pGEx一GDH重組質(zhì)粒的PcR鑒定M.分子量標(biāo)準(zhǔn)(DNAladder);1.PcR產(chǎn)物;2.pGEX礴T一1擴(kuò)增產(chǎn)物;3一又pGEx一ooH擴(kuò)增產(chǎn)物Figl一3.Iden朋eationofreeombinantPGEX一GDHPlasmidbyPCRM.Marker(DNAladder);1.Productsal刀PlifiedfromgenomieDNA之ProduetsamPlifiedfromPGEX-4T一13一7.ProduetsamPlifiedfromPGEX一GDH
【學(xué)位授予單位】：第一軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2002
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2639079