【摘要】：納米科學技術(shù)(Nano-ST)是20世紀80年代末期誕生并正在崛起的新科技，它的基本涵義是在納米尺寸(10~(-10～)10~(-7)m)范圍內(nèi)認識和改造自然，通過直接操作和安排原子、分子創(chuàng)造新物質(zhì)。納米材料作為一種材料的定義把納米顆粒限制到1-100nm的范圍，實際上廣義地講納米材料是指在三維空間中至少有一維處于納米尺度范圍或由它們作為基本單元構(gòu)成的材料。 丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus，簡寫HCV)是一種廣泛傳播的血源性病毒，是輸血引發(fā)的非甲非乙型肝炎的主要致病因子，在我國人群中的感染率約為2％，且與許多原發(fā)性肝癌、肝硬化、自身免疫性肝炎以及暴發(fā)性、病毒性肝炎均有密切關(guān)系。由于目前尚無治療HCV感染的特效藥物，所以對HCV的感染者進行早期檢測，防止其經(jīng)血或其它途徑傳播，是目前阻斷HCV傳播、降低HCV感染率的主要途徑。 目前針對抗HCV抗體的檢測手段主要包括以下三類：酶免疫法(EIA)；重組免疫印跡試驗(RIBA)；多聚體肽(MAP)。另外還有分別針對HCV RNA和HCV抗原的檢測。但相對檢測抗體來說，檢測HCV RNA和HCV抗原在實際應(yīng)用中都還面臨著一定的困難。酶免疫法檢測抗HCV抗體是目前最常用的方法，可作為篩選獻血者及疾病診斷的手段。這一方法的改進主要表現(xiàn)在使用不同的抗原，以提高診斷的靈敏度及特異性。盡管目前主要采用的重組抗原或合成肽抗原檢測試劑有長足的發(fā)展，但這些試劑仍存在一定的缺點。嵌合抗原則兼?zhèn)渲亟M抗原和多聚體肽的優(yōu)點，它去掉了不與抗體結(jié)合的無關(guān)序列，涵蓋來源于HCV基因組和型特異區(qū)的優(yōu)勢表位，克服了基因型差異對抗體檢測的影響，提高了檢測靈敏度和特異性。我們通過分析HCV結(jié)構(gòu)區(qū)、非結(jié)構(gòu)區(qū)蛋白的氨基酸序列以及查閱相關(guān)文獻，克隆表達了包含整個HCV基因序列中優(yōu)勢抗原決定簇位點的蛋白。經(jīng)純化后，可獲得較純的嵌合抗原。 酶免疫法在使用中既需要專門的儀器設(shè)備，又必需有專業(yè)人員操作，且操作復(fù)雜費時。在野戰(zhàn)條件下的血液保存與檢測已成為新時期軍隊后勤建設(shè)的極其重要課題的今天，酶免疫法已遠遠無法滿足現(xiàn)代高科技戰(zhàn)爭的要求。它同樣也無法 碩士學位論文 納米顆粒標記膜層析快速檢測抗HCV抗體試紙的初步研制 實現(xiàn)患者的家庭自檢。這些都需要我們建立一種新的簡便、快速、容易判讀結(jié)果 的HCV檢測方法。免疫層析是出現(xiàn)于20世紀80年代初期的一種獨特的免疫分析 方式。它無需進行結(jié)合標記物和自由標記物的分離，省去了煩瑣的加樣、洗滌過 程，且不需或僅需簡單的儀器。免疫層析快速簡便的特點使其在戰(zhàn)場野外條件、 各級醫(yī)院門急診檢驗及家庭、個人保健等方面得到了廣泛的應(yīng)用。 基于上述目的，我們用克隆得到的丙型肝炎病毒嵌合抗原，應(yīng)用膜免疫層析 技術(shù)初步研制出既可用于戰(zhàn)時血液質(zhì)量鑒定又可在平時HCV感染篩查中發(fā)揮作用 的快速檢測抗HCV抗體試紙。 免疫層析試紙要求在質(zhì)控線包被可以和免疫層析標記復(fù)合物結(jié)合的相應(yīng)物質(zhì)。 根據(jù)此項要求我們用克隆得到的HCV嵌合抗原免疫家兔，抽取兔血制備了針對HCV 嵌合抗原的多抗血清。經(jīng)蛋白G柱純化后效價為1:102400，SDS一PAGE顯示純化 取得了理想的效果。為進一步的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。 找到一個合適的免疫層析標記物是進行一項免疫層析實驗的前提。我們遵循以 下原則對三種納米材料進行了篩選:(l)制備方法是否簡便易行;(2)制備得到 的顆粒是否穩(wěn)定;(3)顆粒標記我們的目的蛋白的過程是否簡單，標記效率是否 較高;(4)顆粒可選擇的粒徑范圍是否能夠滿足我們的需要;(5)形成產(chǎn)品后要 有明顯易判讀的顯色反應(yīng);(6)經(jīng)濟性要好。最終確定以膠體硒作為我們下一步 實驗理想的標記物。硒是一種人們早己熟悉的稀土元素，其黑色元素硒和灰色元 素硒幾乎沒有任何生物活性和毒性�，F(xiàn)在在免疫層析中應(yīng)用的是紅色元素硒。我 們在世界上第一次利用冷法合成出了單質(zhì)紅色納米顆粒硒，并已申報專利(專利 號:02129360.0)，且在國內(nèi)首次將這種納米顆粒硒應(yīng)用于免疫層析試紙中。 為篩選出適合我們實驗的層析材料，我們對多種可用于免疫層析的硝酸纖維素 膜的重要物理學性質(zhì)，如流速、流動的均勻性和背景殘留等進行了比較，最終確 定了適合我們實驗的NC膜。 通過對不同HCV嵌合抗原標記包被緩沖液、不同標記pH緩沖環(huán)境和不同標記 抗原用量實驗，確定了PBS+0.01%SDS為HCV嵌合抗原最佳標記、包被緩沖液，建 立了pHS.5，lml膠體硒比sug抗原的標記標準方案。 通過對層析膜不同的抗原包被量、不同的封閉條件和層析時不同膠體硒標記復(fù) 合物用量的實驗，確定了每條試紙的最適抗原包被量為1.sug，篩選出 Zry0PVP+O.5%Tween一20、室溫、smin的封閉條件和6ul為最佳標記復(fù)合物的用量。 在上述實驗基礎(chǔ)上，我們利用相關(guān)機械設(shè)備，制成HCV試紙的工業(yè)化半成品。 通過各20份的HCV陰、陽性血清對自制試紙進行了初步評價�；就瓿闪吮驹嚰� 的初步研制工作，為下一步規(guī)格化，，實用化，工業(yè)化生產(chǎn)打下了良好的基礎(chǔ)。
【圖文】：

SDS一PAGE鑒定抗體純度。實驗結(jié)果AKTA蛋白純化儀280NM監(jiān)測圖如圖1.1所示。G蛋白是G群鏈球菌的細胞表面蛋白，是一類S型FC受體，結(jié)合在工gG的FC區(qū)域。蛋白G對工gGF。段在中性pH環(huán)境有特異性結(jié)合力，改變pH則結(jié)合力下降而洗脫出抗體。純化并濃縮后的抗體經(jīng)ELISA測定效價達到1:102400。圖1.1抗HCV多克隆抗體純化280NM監(jiān)測圖注:ACDEGH工為上樣峰;BFJ為甘氨酸洗脫峰

納米顆粒標記膜層析快速檢測抗HCV抗體試紙的初步研制電泳結(jié)果如圖1.2，顯示有兩條帶，分別在約24KD和51KD位置。經(jīng)透析及濃縮后在紫外分光光度計上測定抗體在280nm和26Onm波長紫外光下的吸光度值，計算后測得抗體濃度為IOmg/m1，完全符合我們的要求。圖1.2多克隆抗體SDS一PAGE結(jié)果注:Marker自上向下分子量為97.4KD、66.ZKD、43KD、31KD、20.IKD、14.4KD，多抗電泳結(jié)果，兩條帶位置分別在約24KD和51KD討論抗體通常是從血清或腹水中獲得的。盡管直接使用上述未純化的抗體溶液也可以進行一些免疫學實驗，但要在免疫層析實驗中獲得滿意的結(jié)果則要求我們制備純化的抗體。雖然傳統(tǒng)的硫酸錢沉淀的方法也可以用來純化抗體，但由于硫酸錢沉淀法純化后的抗體純度不高
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2003
【分類號】：R392

【引證文獻】

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1 陳珠麗;膠體金免疫層析技術(shù)快速檢測水中微囊藻毒素-LR的研究[D];浙江大學;2011年

本文編號：2633448