【摘要】：丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(HCV)引起，主要通過血源傳播的一種世界性傳染病。流行病學資料表明，HCV感染呈全球性分布，在西方國家的普遍人群感染率為1％，我國高達3.2％。目前全世界至少有1億人攜帶HCV，每年約有1百萬新的HCV感染者。HCV感染后，約有50-80％的感染者發(fā)展為慢性肝炎，在此基礎上約25％的患者最終演變?yōu)楦斡不�，并與肝細胞癌(HCC)的發(fā)生密切相關。HCV基因組變異率高，病毒準種多，目前尚無有效的抗病毒治療藥物。 核酶(Rz)是一類具有酶活性的RNA分子，可序列特異性地結(jié)合并切割靶RNA，從而阻斷靶基因的復制和表達。錘頭結(jié)構(gòu)Rz分子較小、結(jié)構(gòu)簡單、易于設計合成，作為新的抗病毒治療手段，已在多種病毒的基因治療研究中顯示出潛在的應用價值。本研究選擇高度保守的5’NCR和C區(qū)為靶序列，在體外設計合成兩個錘頭結(jié)構(gòu)Rz，研究Rz在體外對靶RNA的切割作用和在細胞內(nèi)對HCV基因表達的抑制作用。同時探討建立帶熒光素酶(luc)報告基因的四環(huán)素調(diào)控性細胞模型的方法。 主要研究內(nèi)容如下： 1 根據(jù)錘頭結(jié)構(gòu)Rz的設計原理，以HCV-H株基因序列為靶，通過對靶RNA二級結(jié)構(gòu)的能量分析，在HCV 5’NCR和C區(qū)選擇出213、260、470和478四個理想的靶位點，設計出Rz的基因序列。為了解這4個Rz的“廣譜性”，分析比較了具有代表性的5株HCV序列，其Rz切點兩翼堿基(7-8nt)的同源性為100％。 2 選擇針對5’NCR的213和260兩位點，在體外合成Rz213和Rz260單鏈基因，通過亞克隆技術將Rz基因插入兩端帶有自剪切Rz的pGENE8459v3載體，然后重組在pcDNA3真核表達載體的CMV啟動子下游。酶切鑒定結(jié)果表明，我們所構(gòu)建的體外轉(zhuǎn)錄載體(pGEM-Rz)、自剪切亞克隆載體(pGENE-Rz)和真核表達載體(pcEM-Rz和pcENE-Rz)的連接正確。為了保證Rz序列的正確性，對pGEM-Rz213進行了手工測序，結(jié)果與設計合成的Rz序列完全一致。 3 應用α-~(32)P-UTP在體外標記靶RNA，通過放射性自顯影方法檢測體外轉(zhuǎn)錄Rz對靶RNA的切割作用，結(jié)果表明Rz213和Rz260均可位點特異性切割靶RNA。 4 通過脂質(zhì)體(lipofectamine)介導的細胞轉(zhuǎn)染，將Rz基因真核表達載體導入體外
【圖文】：

有的免疫應答產(chǎn)生免疫逃逸，或出現(xiàn)缺損病毒(deefctivevi應答效應。2)準種特性。即HCV以一種主要株和多個與之群方式存在于患者體內(nèi)l’2]。3)病毒的低水平復制。在受HC滴度極低，估計約為100個加[l’3】，如此少的病毒含量，可強度的抗HCV免疫反應。4)損傷機體免疫系統(tǒng)卿，’0l，HCV響其抗病毒免疫作用的發(fā)揮。5)機體抗病毒免疫不足或免子之間協(xié)調(diào)不夠，，并可能與HLA系統(tǒng)有關。組RNA的結(jié)構(gòu)和功能組的大小、結(jié)構(gòu)和病毒復制酶等與黃病毒(flvaviiruses)和es)s相似，現(xiàn)已將其歸為黃病毒科的一個新屬t川。目前的研V是一單股正鏈RNA病毒，整個基因組長度約.94kb，由區(qū)(NCR)和一個大的開放讀碼框架(openreadingrfmae，o氨基酸的多聚蛋白(polPyrotein)，在細胞蛋白酶或病毒蛋白酶性基因產(chǎn)物，即結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白6]I。結(jié)構(gòu)蛋白有核心白(E蛋白)，非結(jié)構(gòu)蛋白包括NSZ、NS3、NS4A、NS4B、HCV基因組結(jié)構(gòu)、多蛋白的加工過程及其功能見圖1和表1

醫(yī)大學博士學位論文博士生賈戰(zhàn)生導師周永興教碼區(qū)(nonoeodingergion，NCR)ev基因組的5’端和3’端各有一NCR(也稱非轉(zhuǎn)錄區(qū)uninarsplatingerg核昔酸序列分別為5’NCR約324一34lbp，3’NeR27一55bp。該區(qū)的大V的來源和基因型的不同。CR在HCv基因組中5’NCR最為保守，是PcR診斷試劑、基因分型治療選擇的理想靶序列。與一般病毒不同，HCVS’NCR內(nèi)部含有多這些小的O盯是否能表達或履行某種功能目前尚不清楚[’7]。此外，在H發(fā)現(xiàn)了三個高度保守的結(jié)構(gòu)域(domains)，它們分別位于該區(qū)的3一65、6一263位[45]。前兩個結(jié)構(gòu)域可能與HCV的進化有關，第三個結(jié)構(gòu)與對H翻譯至關重要1261。對來自全球范圍內(nèi)12個國家的44份血樣作序列測該區(qū)的同源性在90%以上，與HCV基因型多、易變異的特點形成鮮NCR的二級結(jié)構(gòu)模式由Borwn等{49}首先提出，后得到了不同研究結(jié)rown將HCvs’NCR與幾株瘟病毒的5’NCR序列和熱力學模型相比較，機分析，模擬出5’NCR的二級結(jié)構(gòu)模式圖2。
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：1998
【分類號】：R346

【參考文獻】

相關期刊論文 前10條

1 譚文杰,叢郁,李光三,畢勝利,杜淼,詹美云;丙型肝炎病毒結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)基因小鼠的建立[J];病毒學報;1997年01期

2 顏子穎,喬健,貢惠宇,王海林,李艷春,侯云德;特異性導向肝細胞表達和復制的EB病毒載體系統(tǒng)的組建[J];病毒學報;1997年02期

3 趙永同,金明,王剛,朱峰,惠宏襄,王成濟;針對bcl─2RNA核酶體外切割反應的瓊脂糖凝膠電泳[J];第四軍醫(yī)大學學報;1996年01期

4 王海平,周永興,姚志強,洪沙,李光玉;成年樹鄋實驗感染丙型肝炎病毒的初步研究[J];第四軍醫(yī)大學學報;1997年04期

5 連建奇,周永興,金由辛;抗HBVC基因核酶自剪切轉(zhuǎn)錄載體的構(gòu)建[J];第四軍醫(yī)大學學報;1997年04期

6 賈戰(zhàn)生;丙型肝炎病毒體外細胞培養(yǎng)和動物模型的研究進展[J];國外醫(yī)學(流行病學傳染病學分冊);1996年03期

7 夏寧邵,畢勝利,楊永平,趙同興,金冬雁,季維智,洪寧,田保平,湯權(quán),劉敏,謝德勝,詹美云;中國株丙型肝炎病毒實驗感染3種獼猴的初步結(jié)果[J];中國科學(B輯 化學 生命科學 地學);1995年07期

8 陸長德，陳農(nóng)安，祁國榮;核酶對靶RNA的體外切割反應的計算機分析[J];生物化學與生物物理學報;1996年03期

9 李勇年;王勤環(huán);斯崇文;于敏;張琦;;反義寡脫氧核苷酸對丙型肝炎病毒基因表達的抑制作用[J];中華傳染病雜志;1997年04期

10 劉勇，陳智，劉克洲，何南祥，章明太，王信子;重組丙型肝炎病毒基因轉(zhuǎn)染H9細胞模型的建立[J];中華肝臟病雜志;1997年02期

本文編號：2632747