本文關(guān)鍵詞：PBDC1和NonO蛋白在紅系分化過程中的功能研究及UPF0538蛋白的抗體制備，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：細胞分化與去分化是生命科學領域中的一個研究熱點,對其機制的研究為腫瘤的發(fā)生及防治提供重要依據(jù)。哺乳類紅系細胞的分化具有明顯的時序性變化,當細胞進入終末分化時出現(xiàn):停止分裂、細胞體積逐漸減小、細胞核固縮、排核和特異蛋白-血紅蛋白的表達等變化。小鼠胎肝是小鼠早期的主要造血器官,紅系細胞在胎肝E10.5~E17.5造血過程中發(fā)生并完成終末造血過程,已成為研究體內(nèi)紅系分化的良好模型。此外,現(xiàn)已證實多種誘導劑能誘導紅白血病細胞重新進入分化階段,表達血紅蛋白,這也是紅系分化與癌變的另一個模型。在本實驗室的前期工作中,利用差異蛋白質(zhì)組學技術(shù)鑒定出丁酸鈉誘導小鼠紅白血病(Murine eryt hroleukemia,MEL)細胞向紅系細胞分化過程和小鼠胎肝造血過程中有許多差異表達的蛋白質(zhì)。其中既有一些已經(jīng)有一定功能研究基礎的蛋白質(zhì),例如:NPM1、P irin、RbAp48、NonO等;也有一些功能和高級結(jié)構(gòu)未知的蛋白質(zhì),例如:PBDC1、UPF0538等。本文用細胞與分子生物學技術(shù)和方法研究PBDC1和NonO蛋白在紅系分化過程中的功能,以及UPF0538蛋白的抗體制備。結(jié)果表明PBDC 1在MEL細胞和小鼠胎肝細胞中主要定位于細胞質(zhì),也有少量定位于細胞核。GS T沉降實驗鑒定出159個PBDC1的潛在相互作用蛋白,其中有很大一部分肽酶和氧化還原酶,還有一些GTP結(jié)合蛋白、電子轉(zhuǎn)移蛋白、鐵離子結(jié)合蛋白,猜測PBDC1可能參與細胞內(nèi)的氧化還原反應,電子轉(zhuǎn)移,鐵離子結(jié)合等過程,但需后續(xù)實驗驗證。此前,我們發(fā)現(xiàn)在SB誘導MEL分化過程中,NonO蛋白表達呈上調(diào)趨勢,并且與紅系負調(diào)控因子PU.1共定位,這說明NonO可能參與紅系分化的調(diào)控。本文中為進一步研究NonO蛋白在MEL細胞分化中的作用,通過shRNA干擾方式構(gòu)建了低表達NonO穩(wěn)定細胞株。MTT比色法結(jié)果表明,NonO的低表達會抑制MEL細胞的增殖活力。Western blot鑒定結(jié)果表明低表達NonO蛋白會引起c-myc蛋白表達下調(diào),而c-myc在調(diào)控紅系分化方面有重要作用。由此可推測,NonO通過c-myc和P U.1調(diào)控紅系分化過程。UPF0538是一個功能和高級結(jié)構(gòu)未知的蛋白質(zhì),目前還沒有商品化的抗體。為研究UPF0538在分化過程中的功能,我們利用原核表達系統(tǒng)獲得大量的UPF0538融合蛋白,并以此免疫新西蘭大白兔,制備了其多克隆抗體,為研究UPF0538的功能提供了基礎。
【關(guān)鍵詞】：紅系分化 NonO PBDC 1 UPF0538 丁酸鈉 小鼠白血病細胞 抗體制備
【學位授予單位】：浙江理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R392.11
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 縮略表8-12
• 第一章 緒論12-17
• 1 研究背景、目的及意義12-14
• 1.1 研究背景12-13
• 1.2 研究目的及意義13-14
• 2 NonO蛋白的研究現(xiàn)狀14-15
• 2.1 NonO蛋白的發(fā)現(xiàn)14
• 2.2 NonO蛋白亞細胞定位與功能14-15
• 3 PBDC1和UPF0538的研究現(xiàn)狀15
• 4 技術(shù)路線15-17
• 第二章 PBDC1和NonO蛋白在紅系分化過程中的的功能研究17-57
• 1 前言17-18
• 2 材料與方法18-39
• 2.1 材料、試劑及實驗儀器18-22
• 2.1.1 細胞、菌株和質(zhì)粒18
• 2.1.2 主要試劑18-20
• 2.1.3 主要儀器20
• 2.1.4 主要試劑配制20-22
• 2.2 實驗方法22-39
• 2.2.1 Westernblot檢測PBDC1在MEL細胞分化中的表達情況22-23
• 2.2.2 Westernblot檢測PBDC1在小鼠胎肝E11.5~E15.5 的表達情況23
• 2.2.3 免疫細胞化學實驗檢測PBDC1在MEL細胞的亞細胞定位23-24
• 2.2.4 免疫細胞化學實驗檢測PBDC1在小鼠胎肝細胞中的定位24
• 2.2.5 細胞培養(yǎng)24
• 2.2.6 細胞總RNA的提取24-25
• 2.2.7 RNA的反轉(zhuǎn)錄25
• 2.2.8 PBDC1 基因的引物設計25
• 2.2.9 PBDC1 基因的克隆25-26
• 2.2.10 表達載體pGEX-4T1PBDC1的構(gòu)建26-30
• 2.2.11 PBDC1融合蛋白的表達30-31
• 2.2.12 GST-Pull Down實驗鑒定PBDC1的相互作用蛋白31-33
• 2.2.13 干擾載體pLKO.1-NonO-shRNA的構(gòu)建33-37
• 2.2.14 慢病毒的包裝37-38
• 2.2.15 低表達NonO的MEL細胞穩(wěn)定株的建立38
• 2.2.16 Westernblot驗證低表達NonO的MEL細胞穩(wěn)定株38-39
• 2.2.17 Westernblot驗證低表達NonO對紅系相關(guān)蛋白表達的影響39
• 2.2.18 MTT比色法檢測低表達NonO對MEL細胞活力的影響39
• 3 結(jié)果39-55
• 3.1 PBDC1在 紅系分化中的表達變化39-40
• 3.1.1 PBDC1 在丁酸鈉誘導MEL細胞分化中的表達情況39-40
• 3.1.2 PBDC1 在E11.5~E15.5小鼠胎肝的表達情況40
• 3.2 PBDC1的細胞定位40-42
• 3.2.1 PBDC1在MEL細胞中的定位40-41
• 3.2.2 PBDC1在小鼠胎肝細胞中的定位41-42
• 3.3 表達載體pGEX-4T1P BDC1的構(gòu)建42-44
• 3.3.1 PCR擴增PBDC1基因42-43
• 3.3.2 重組質(zhì)粒pGEX-4T1PBDC1的鑒定43-44
• 3.4 PBDC融合蛋白的誘導表達44-45
• 3.5 GST-Pull Down鑒定PBDC1相互作用蛋白與驗證及生物信息學分析45-52
• 3.5.1 PBDC1 相互作用蛋白的鑒定45-50
• 3.5.2 GST-Pull Down結(jié)果驗證50-51
• 3.5.3 PBDC1 相互作用蛋白生物信息學分析51-52
• 3.6 干擾載體pLKO.1-NonO-shRNA的鑒定52-53
• 3.6.1 干擾載體pLKO.1-NonO-shRNA的酶切鑒定52
• 3.6.2 干擾載體pLKO.1-NonO-shRNA的測序鑒定52-53
• 3.7 病毒包裝時轉(zhuǎn)染效率的檢測53
• 3.8 低表達NonO的MEL細胞穩(wěn)定株的篩選及鑒定53-54
• 3.9 低表達NonO對MEL細胞活力的影響54-55
• 3.10 低表達NonO對紅系相關(guān)基因表達的影響55
• 3.12 低表達NonO對丁酸鈉誘導MEL細胞分化的影響55
• 4 討論55-57
• 第三章 UPF0538蛋白的抗體制備57-69
• 1 前言57
• 2 材料與方法57-65
• 2.1 實驗材料、試劑及儀器57-59
• 2.1.1 菌株及質(zhì)粒57
• 2.1.2 實驗動物57
• 2.1.3 試劑57-58
• 2.1.4 儀器58-59
• 2.1.5 主要試劑的配制59
• 2.2 實驗方法59-65
• 2.2.1 重組pET-28a(+)-UPF0538質(zhì)粒的構(gòu)建59-62
• 2.2.2 重組pET-28a(+)-UPF0538質(zhì)粒的鑒定62-63
• 2.2.3 UPF0538蛋白的表達、純化及鑒定63-64
• 2.2.4 UPF0538多克隆抗體的制備、純化及鑒定64-65
• 3 結(jié)果65-68
• 3.1 PCR擴增UPF0538基因65
• 3.2 重組質(zhì)粒pET-28a(+)-UPF0538的鑒定65-66
• 3.2.1 重組質(zhì)粒pET-28a(+)-UPF0538的酶切鑒定65-66
• 3.2.2 重組質(zhì)粒pET-28a(+)-UPF0538的測序鑒定66
• 3.3 UPF0538蛋白的表達及可溶性分析66-67
• 3.4 UPF0538蛋白的純化及鑒定67-68
• 3.5 UPF0538多克隆抗體的Western blot檢測68
• 4 討論68-69
• 第四章 結(jié)論和展望69-70
• 1 結(jié)論69
• 2 展望69-70
• 參考文獻70-74
• 致謝74-75
• 攻讀學位期間的研究成果75

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