【摘要】：血吸蟲病是一種嚴(yán)重危害人類健康的人獸共患寄生蟲病。目前的防治策略主要是以吡喹酮化療為主，結(jié)合藥物滅螺、環(huán)境改造和健康教育的綜合措施。鑒于歷史上許多感染性疾病的控制均依賴于高效疫苗的成功研制和對血吸蟲病免疫認(rèn)識的逐步深入，作為綜合防治措施之一，世界衛(wèi)生組織已把發(fā)展血吸蟲病疫苗確定為優(yōu)先發(fā)展的戰(zhàn)略。 目前，國內(nèi)外研制的血吸蟲病疫苗候選分子的保護(hù)力尚不夠理想。其原因除了單一抗原分子不能誘導(dǎo)足夠的免疫應(yīng)答外，也可能與其所含的抗原表位的構(gòu)成和性質(zhì)有關(guān)。無論動物實(shí)驗(yàn)還是人群血吸蟲病的免疫流行病學(xué)研究均提示Th1型應(yīng)答在免疫保護(hù)中具有重要作用。因此，構(gòu)建由誘導(dǎo)Th1應(yīng)答的表位組成的復(fù)合多價疫苗或許能夠提高免疫保護(hù)性。 本研究運(yùn)用生物信息學(xué)方法分析和預(yù)測日本血吸蟲線粒體相關(guān)蛋白(Sj338)、22.6 kDa膜相關(guān)抗原(Sj22.6)、磷酸丙糖異構(gòu)酶(SjTPI)和97 kDa副肌球蛋白(Sj97)的T細(xì)胞表位，設(shè)計并合成候選表位的編碼核苷酸，定向克隆入融合表達(dá)載體pET-32c(+)，誘導(dǎo)表達(dá)硫氧還蛋白(Trx)融合蛋白。候選表位融合蛋白純化后體外刺激小鼠淋巴細(xì)胞，經(jīng)淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞因子分泌實(shí)驗(yàn)鑒定出若干能誘導(dǎo)Th1型細(xì)胞因子產(chǎn)生的T細(xì)胞表位。其中P4(來源于Sj22.6)、P18(來源于SjTPI)和P22(來源于Sj97)能夠誘導(dǎo)較強(qiáng)的淋巴細(xì)胞增殖和Th1型細(xì)胞因子產(chǎn)生。同時對此三個T細(xì)胞表位進(jìn)行了同源性分析，并進(jìn)一步對P4、P22的免疫原性及P18與自然感染血吸蟲小鼠淋巴細(xì)胞的反應(yīng)性進(jìn)行了研究。 第—部分：日本血吸蟲抗原T細(xì)胞表位的預(yù)測、基因重組、表達(dá)及純化 根據(jù)Sj22.6、Sj338、SjTPI和Sj97的氨基酸序列，用TEPITOPE、SYFPEITHI等計算機(jī)軟件預(yù)測其T細(xì)胞表位，確定了候選表位14個。 南京醫(yī)科大學(xué)碩卜學(xué)位論文 設(shè)計候選表位的編碼核普酸，定向克隆入融合表達(dá)載體 PET-32c(+)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BLZI，氨節(jié)青霉素瓊脂板篩選陽性克隆。 重組質(zhì)粒(表位基因/P ET-32c(+))經(jīng)酶切及測序鑒定。測序結(jié)果顯示基 因序列與設(shè)計完全一致，表明候選表位基因成功克隆入融合表達(dá)載體 pET-32c(+)。 為獲得大量可溶性的候選表位融合蛋白(表位~Trx)，對不同IPTG 誘導(dǎo)濃度、誘導(dǎo)表達(dá)時間等因素對融合蛋白表達(dá)量的影響進(jìn)行了觀察。 結(jié)果顯示，大多rl丫x融合蛋白在1 .0 mm0llL lpTG誘導(dǎo)3h表達(dá)量均較 高，而P6lT注在0.4 mmo此IpTG誘導(dǎo)Zh表達(dá)量最高. 以最佳誘導(dǎo)條件大量表達(dá)Trx融合蛋白，表達(dá)菌體培養(yǎng)物置一70 ℃，融化后離心取上清。用Ni2+~NTA柱親和層析純化目的蛋白并在PBS 中透析。透析后蛋白經(jīng)SDS一PAGE觀察其純度并測定濃度。結(jié)果表明， 純化后的融合蛋白呈均一性，在sDSPAGE上無任何可見雜帶。 第二部分日本血吸蟲杭原T細(xì)胞表位的鑒定 為鑒定血吸蟲特異性的T細(xì)月包表位，首先以日本血吸蟲照射尾坳 免疫C3H/H eJ及C57BL/6，J、鼠，5周后分別以rsj22.6、rsj338、rsjTpl 和S認(rèn)叭P加不完全福氏佐劑(IFA)尾基部皮下注射加強(qiáng)免疫。7一10 天后無菌取腹股溝淋巴結(jié)及脾臟，制備淋巴細(xì)胞懸液。用純化的候選 表位融合蛋白與上述細(xì)胞共培養(yǎng)，’H一TdR摻入法檢測其增殖。結(jié)果顯 示，候選表位融合蛋白中大部分可刺激致敏淋巴細(xì)胞增殖而不能刺激 ，j、鼠幼稚淋巴細(xì)胞增殖，表明候選表位中大部分為日本血吸蟲特異性T 細(xì)胞表位。 為排除融合蛋白中擔(dān)體蛋白部分對實(shí)驗(yàn)的干擾，我們又合成了部 分候選表位的氨基酸膚段。同上進(jìn)才洲林巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞因子分 泌的檢測。結(jié)果顯示，合成膚與重組膚刺激淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的增殖及細(xì) 胞因子的分泌基本一致，，表明表位膚與，n籃融合蛋白可以替代合成膚 進(jìn)行T細(xì)胞表位的篩選與鑒定。 在來源于22 .6切a抗原的4個候選表位中(用TEPITOPE軟件預(yù) 測獲得)，其中3個(P4、PS、P6)既能誘導(dǎo)C3IJ/HeJ(井Zk)小鼠的 致敏淋巴細(xì)胞增殖，又能誘導(dǎo)C 57BL/6(H-2“)，卜鼠的致敏淋巴細(xì)胞增 殖，提示P4、Ps、P6可能是通用性T細(xì)胞表位。在來源于副月心味蛋 白的5個候選表位中(用SYFPEIT扭軟件根據(jù)H一ZAK和H一ZEK基序 南京醫(yī)科大學(xué)碩l學(xué)位論義 預(yù)測獲得的擠Zk限制性候選T細(xì)胞表位)，有4個(PZo、PZI、P22、 P23)可刺激C3H汗leJ，」、鼠的致敏淋巴細(xì)胞增殖，僅兩個(P20、P22) 可誘導(dǎo)C57BU6小鼠的致敏淋巴細(xì)胞增殖，提示P20、件2可能為通 用性T細(xì)胞表位，而PZI、P23可能為MHC限制性T細(xì)胞表位。 TEprr0PE和SYFpEITHI軟件預(yù)測T細(xì)胞表位具有較高的準(zhǔn)確性. 為進(jìn)一步篩選可用于構(gòu)建多表位疫苗的可誘導(dǎo)Thl應(yīng)答的T細(xì)胞 表位，同上免疫小鼠，制備淋巴細(xì)胞懸液。用純化的候選表位融合蛋 白與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)24、48小時后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清。EUSA雙抗體 夾，訟法用QuantikineM試劑盒檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL一2及IFN一Y的含 量。結(jié)果顯示，上述鑒定的表位中大部分能刺激致敏淋巴細(xì)胞分泌IL一2 及IFN一y，其中以P4、P18和P22能較強(qiáng)誘導(dǎo)，rk1型細(xì)胞因于的產(chǎn) 生。 將表位P4、P 18、P22氨基酸序列上BLAST進(jìn)行比對。結(jié)果顯示， P4、P18、P22與哺乳動物無明顯序列同源性。 一個有潛力的疫苗候選分子必須具有良好的免疫原性。為觀察所 選
【圖文】：

TEPITOPE軟件預(yù)測主頁Fig.2ThehomePageofTEPITOPEsoftware

泳動速度明顯變慢，表明退火成功(圖4)。23圖4(o2l019)候選表位基因退火后聚丙烯酸胺凝膠電泳結(jié)果泳道1:單鏈核普酸泳道2:退火后雙鏈核普酸泳道3:DL2000Fig.1PAGEofthecandidateePitoPegene叭erannealingLanel:singlest“tndLaneZ:doublest攏IndLane3:DL20003.重組及鑒定我們發(fā)現(xiàn)，在小基因與質(zhì)粒重組時，只要插入片段的摩爾數(shù)遠(yuǎn)大于載體片段，即可較順利重組成功，而不必局限于文獻(xiàn)所述3:1一10:1的摩爾比。候選表位基因重組入載體PET-32c(+)后，五沁口Rl酶切位點(diǎn)消失，故不能被EcoRI酶解(見圖5)。質(zhì)粒一般存在三種形式，即超螺旋環(huán)狀(I型)、切口環(huán)狀(11型)及線狀(m型)，電泳時一般呈三條帶149](但也有例外，如圖5中2、3泳道)，當(dāng)限制性內(nèi)切酶將質(zhì)粒切開成線性時，電泳呈一條帶。但我們發(fā)現(xiàn)，部分質(zhì)粒在經(jīng)限制性
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號】：R392

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本文編號：2628460