【摘要】：血吸蟲(chóng)病是一種嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的人獸共患寄生蟲(chóng)病。目前的防治策略主要是以吡喹酮化療為主，結(jié)合藥物滅螺、環(huán)境改造和健康教育的綜合措施。鑒于歷史上許多感染性疾病的控制均依賴(lài)于高效疫苗的成功研制和對(duì)血吸蟲(chóng)病免疫認(rèn)識(shí)的逐步深入，作為綜合防治措施之一，世界衛(wèi)生組織已把發(fā)展血吸蟲(chóng)病疫苗確定為優(yōu)先發(fā)展的戰(zhàn)略。 目前，國(guó)內(nèi)外研制的血吸蟲(chóng)病疫苗候選分子的保護(hù)力尚不夠理想。其原因除了單一抗原分子不能誘導(dǎo)足夠的免疫應(yīng)答外，也可能與其所含的抗原表位的構(gòu)成和性質(zhì)有關(guān)。無(wú)論動(dòng)物實(shí)驗(yàn)還是人群血吸蟲(chóng)病的免疫流行病學(xué)研究均提示Th1型應(yīng)答在免疫保護(hù)中具有重要作用。因此，構(gòu)建由誘導(dǎo)Th1應(yīng)答的表位組成的復(fù)合多價(jià)疫苗或許能夠提高免疫保護(hù)性。 本研究運(yùn)用生物信息學(xué)方法分析和預(yù)測(cè)日本血吸蟲(chóng)線(xiàn)粒體相關(guān)蛋白(Sj338)、22.6 kDa膜相關(guān)抗原(Sj22.6)、磷酸丙糖異構(gòu)酶(SjTPI)和97 kDa副肌球蛋白(Sj97)的T細(xì)胞表位，設(shè)計(jì)并合成候選表位的編碼核苷酸，定向克隆入融合表達(dá)載體pET-32c(+)，誘導(dǎo)表達(dá)硫氧還蛋白(Trx)融合蛋白。候選表位融合蛋白純化后體外刺激小鼠淋巴細(xì)胞，經(jīng)淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞因子分泌實(shí)驗(yàn)鑒定出若干能誘導(dǎo)Th1型細(xì)胞因子產(chǎn)生的T細(xì)胞表位。其中P4(來(lái)源于Sj22.6)、P18(來(lái)源于SjTPI)和P22(來(lái)源于Sj97)能夠誘導(dǎo)較強(qiáng)的淋巴細(xì)胞增殖和Th1型細(xì)胞因子產(chǎn)生。同時(shí)對(duì)此三個(gè)T細(xì)胞表位進(jìn)行了同源性分析，并進(jìn)一步對(duì)P4、P22的免疫原性及P18與自然感染血吸蟲(chóng)小鼠淋巴細(xì)胞的反應(yīng)性進(jìn)行了研究。 第—部分：日本血吸蟲(chóng)抗原T細(xì)胞表位的預(yù)測(cè)、基因重組、表達(dá)及純化 根據(jù)Sj22.6、Sj338、SjTPI和Sj97的氨基酸序列，用TEPITOPE、SYFPEITHI等計(jì)算機(jī)軟件預(yù)測(cè)其T細(xì)胞表位，確定了候選表位14個(gè)。 南京醫(yī)科大學(xué)碩卜學(xué)位論文 設(shè)計(jì)候選表位的編碼核普酸，定向克隆入融合表達(dá)載體 PET-32c(+)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BLZI，氨節(jié)青霉素瓊脂板篩選陽(yáng)性克隆。 重組質(zhì)粒(表位基因/P ET-32c(+))經(jīng)酶切及測(cè)序鑒定。測(cè)序結(jié)果顯示基 因序列與設(shè)計(jì)完全一致，表明候選表位基因成功克隆入融合表達(dá)載體 pET-32c(+)。 為獲得大量可溶性的候選表位融合蛋白(表位~Trx)，對(duì)不同IPTG 誘導(dǎo)濃度、誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間等因素對(duì)融合蛋白表達(dá)量的影響進(jìn)行了觀(guān)察。 結(jié)果顯示，大多rl丫x融合蛋白在1 .0 mm0llL lpTG誘導(dǎo)3h表達(dá)量均較 高，而P6lT注在0.4 mmo此IpTG誘導(dǎo)Zh表達(dá)量最高. 以最佳誘導(dǎo)條件大量表達(dá)Trx融合蛋白，表達(dá)菌體培養(yǎng)物置一70 ℃，融化后離心取上清。用Ni2+~NTA柱親和層析純化目的蛋白并在PBS 中透析。透析后蛋白經(jīng)SDS一PAGE觀(guān)察其純度并測(cè)定濃度。結(jié)果表明， 純化后的融合蛋白呈均一性，在sDSPAGE上無(wú)任何可見(jiàn)雜帶。 第二部分日本血吸蟲(chóng)杭原T細(xì)胞表位的鑒定 為鑒定血吸蟲(chóng)特異性的T細(xì)月包表位，首先以日本血吸蟲(chóng)照射尾坳 免疫C3H/H eJ及C57BL/6，J、鼠，5周后分別以rsj22.6、rsj338、rsjTpl 和S認(rèn)叭P加不完全福氏佐劑(IFA)尾基部皮下注射加強(qiáng)免疫。7一10 天后無(wú)菌取腹股溝淋巴結(jié)及脾臟，制備淋巴細(xì)胞懸液。用純化的候選 表位融合蛋白與上述細(xì)胞共培養(yǎng)，’H一TdR摻入法檢測(cè)其增殖。結(jié)果顯 示，候選表位融合蛋白中大部分可刺激致敏淋巴細(xì)胞增殖而不能刺激 ，j、鼠幼稚淋巴細(xì)胞增殖，表明候選表位中大部分為日本血吸蟲(chóng)特異性T 細(xì)胞表位。 為排除融合蛋白中擔(dān)體蛋白部分對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾，我們又合成了部 分候選表位的氨基酸膚段。同上進(jìn)才洲林巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞因子分 泌的檢測(cè)。結(jié)果顯示，合成膚與重組膚刺激淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的增殖及細(xì) 胞因子的分泌基本一致，，表明表位膚與，n籃融合蛋白可以替代合成膚 進(jìn)行T細(xì)胞表位的篩選與鑒定。 在來(lái)源于22 .6切a抗原的4個(gè)候選表位中(用TEPITOPE軟件預(yù) 測(cè)獲得)，其中3個(gè)(P4、PS、P6)既能誘導(dǎo)C3IJ/HeJ(井Zk)小鼠的 致敏淋巴細(xì)胞增殖，又能誘導(dǎo)C 57BL/6(H-2“)，卜鼠的致敏淋巴細(xì)胞增 殖，提示P4、Ps、P6可能是通用性T細(xì)胞表位。在來(lái)源于副月心味蛋 白的5個(gè)候選表位中(用SYFPEIT扭軟件根據(jù)H一ZAK和H一ZEK基序 南京醫(yī)科大學(xué)碩l學(xué)位論義 預(yù)測(cè)獲得的擠Zk限制性候選T細(xì)胞表位)，有4個(gè)(PZo、PZI、P22、 P23)可刺激C3H汗leJ，」、鼠的致敏淋巴細(xì)胞增殖，僅兩個(gè)(P20、P22) 可誘導(dǎo)C57BU6小鼠的致敏淋巴細(xì)胞增殖，提示P20、件2可能為通 用性T細(xì)胞表位，而PZI、P23可能為MHC限制性T細(xì)胞表位。 TEprr0PE和SYFpEITHI軟件預(yù)測(cè)T細(xì)胞表位具有較高的準(zhǔn)確性. 為進(jìn)一步篩選可用于構(gòu)建多表位疫苗的可誘導(dǎo)Thl應(yīng)答的T細(xì)胞 表位，同上免疫小鼠，制備淋巴細(xì)胞懸液。用純化的候選表位融合蛋 白與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)24、48小時(shí)后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清。EUSA雙抗體 夾，訟法用QuantikineM試劑盒檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL一2及IFN一Y的含 量。結(jié)果顯示，上述鑒定的表位中大部分能刺激致敏淋巴細(xì)胞分泌IL一2 及IFN一y，其中以P4、P18和P22能較強(qiáng)誘導(dǎo)，rk1型細(xì)胞因于的產(chǎn) 生。 將表位P4、P 18、P22氨基酸序列上BLAST進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果顯示， P4、P18、P22與哺乳動(dòng)物無(wú)明顯序列同源性。 一個(gè)有潛力的疫苗候選分子必須具有良好的免疫原性。為觀(guān)察所 選
【圖文】：

TEPITOPE軟件預(yù)測(cè)主頁(yè)Fig.2ThehomePageofTEPITOPEsoftware

泳動(dòng)速度明顯變慢，表明退火成功(圖4)。23圖4(o2l019)候選表位基因退火后聚丙烯酸胺凝膠電泳結(jié)果泳道1:單鏈核普酸泳道2:退火后雙鏈核普酸泳道3:DL2000Fig.1PAGEofthecandidateePitoPegene叭erannealingLanel:singlest“tndLaneZ:doublest攏IndLane3:DL20003.重組及鑒定我們發(fā)現(xiàn)，在小基因與質(zhì)粒重組時(shí)，只要插入片段的摩爾數(shù)遠(yuǎn)大于載體片段，即可較順利重組成功，而不必局限于文獻(xiàn)所述3:1一10:1的摩爾比。候選表位基因重組入載體PET-32c(+)后，五沁口Rl酶切位點(diǎn)消失，故不能被EcoRI酶解(見(jiàn)圖5)。質(zhì)粒一般存在三種形式，即超螺旋環(huán)狀(I型)、切口環(huán)狀(11型)及線(xiàn)狀(m型)，電泳時(shí)一般呈三條帶149](但也有例外，如圖5中2、3泳道)，當(dāng)限制性?xún)?nèi)切酶將質(zhì)粒切開(kāi)成線(xiàn)性時(shí)，電泳呈一條帶。但我們發(fā)現(xiàn)，部分質(zhì)粒在經(jīng)限制性
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類(lèi)號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2628460