【摘要】： 硫芥是一類能直接損傷組織細(xì)胞、引起局部炎癥、吸收后并能導(dǎo)致全身中毒的化學(xué)物質(zhì)。大量研究表明，硫芥中毒可抑制免疫系統(tǒng)進(jìn)而引發(fā)機會感染，導(dǎo)致敗血癥甚至死亡。硫芥中毒機體免疫功能抑制, 具有發(fā)生早、恢復(fù)快的特點。淋巴細(xì)胞是機體的主要免疫細(xì)胞，執(zhí)行著多種免疫功能。 研究發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞對硫芥非常敏感, 淋巴細(xì)胞顯著減少被認(rèn)為是硫芥中毒致免疫系統(tǒng)功能低下的重要原因之一，但硫芥中毒淋巴細(xì)胞減少的細(xì)胞毒作用機理目前尚未完全闡明，因而對于硫芥中毒的早期診斷和防治仍無明顯有效的措施。 目的：硫芥引起的細(xì)胞死亡方式有兩種不同形式：即細(xì)胞壞死和細(xì)胞凋亡。本課題以大鼠脾臟淋巴細(xì)胞為中毒模型，探討了硫芥誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞凋亡以及Caspase-3在硫芥誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞凋亡中的作用，期望能為硫芥細(xì)胞毒作用致淋巴細(xì)胞減少免疫系統(tǒng)損傷抑制的規(guī)律和特點提供更深層次的認(rèn)識；同時探索以Caspases蛋白酶為靶點的新藥合成，為硫芥中毒的早期檢測和防治開辟新的途徑。 方法：(1) 離體淋巴細(xì)胞染毒模型：分離提取Wistar大鼠脾臟淋巴細(xì)胞并進(jìn)行培養(yǎng)。進(jìn)行DNA-EB結(jié)合物相對熒光強度、DNA ladder以及細(xì)胞凋亡指數(shù)和細(xì)胞周期檢測，作為硫芥中毒淋巴細(xì)胞損傷的標(biāo)志；RT-PCR、Western blot、熒光定量法分析檢測Caspase-3 mRNA、蛋白表達(dá)活化和Caspase-3活性等指標(biāo)；采用羅丹明123標(biāo)記的熒光探針檢測線粒體跨膜電位；同時觀察了Caspase-3抑制劑四肽(Ac-DEVD-CHO)對硫芥細(xì)胞凋亡作用的干預(yù)效應(yīng)。(2) 在體動物中毒模型：將Wistar大鼠隨機分為正常對照組和實驗組。實驗組腹腔注射硫芥(3.5mg/kg)，對照組則以等量的生理鹽水代替。觀察大鼠硫芥中毒的臨床癥狀并進(jìn)行記錄。實驗組于中毒后1d、3d、5d不同時相點活殺取材，蘇木素—伊紅染色檢測脾臟組織形態(tài)學(xué)變化，RT-PCR檢測凋亡相關(guān)基因Caspase-3 mRNA的表達(dá)。 結(jié)果：(1) 淋巴細(xì)胞凋亡指數(shù)隨染毒時間延長而呈漸增趨勢，中毒后 24h仍保持較高水平。Ac-DEVD-CHO干預(yù)組，各相應(yīng)時相點淋巴細(xì)胞凋亡指數(shù)較單純中毒組顯著減少。(2) 淋巴細(xì)胞DNA降解分析顯示，DNA ladder“梯狀”圖譜隨硫芥作用時間的延長而逐漸明顯。Ac-DEVD-CHO干預(yù)組，DNA ladder“梯狀”圖譜消失或不明顯。(3) 硫芥可干擾淋巴細(xì)胞生長周期，，硫芥作用后S期和G2/M期細(xì)胞迅速下降, 大量淋 WP=9 巴細(xì)胞生長阻滯在G1/G0期。(4) RT-PCR結(jié)果顯示Caspase-3 mRNA表達(dá)在染毒3h后即出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄加強，與對照組比較顯著升高。(5) 硫芥可誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞半胱氨酸蛋白酶Caspase-3蛋白的表達(dá)和活化，染毒后9h Pro-caspase-3表達(dá)增加，3h即可檢測到前蛋白酶原的水解活性亞單位P20片段。(6) 熒光定量法顯示淋巴細(xì)胞染毒后3小時Caspase-3的活性出現(xiàn)顯著性增強。(7) 淋巴細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)中毒后9h表達(dá)減弱，其后繼續(xù)下降。(8) 硫芥染毒淋巴細(xì)胞，線粒體膜去極化，跨膜電位于3h后即出現(xiàn)顯著降低。(9) 硫芥中毒大鼠，脾臟組織形態(tài)學(xué)發(fā)生病理改變的同時，其凋亡相關(guān)基因Caspase-3 mRNA的表達(dá)也出現(xiàn)了變化。 結(jié)論：上述結(jié)果提示：(1) 細(xì)胞凋亡及促凋亡蛋白Caspase-3和抑凋亡蛋白Bcl-2共同參與了硫芥的淋巴細(xì)胞的毒性作用。硫芥誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞凋亡是基因調(diào)節(jié)的細(xì)胞死亡，更確切的說是多種相關(guān)基因共同調(diào)節(jié)后的結(jié)果，它們的異常改變決定了硫芥對淋巴細(xì)胞的毒性作用。(2)Caspase-3以多種形式參與了硫芥誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞凋亡，包括基因表達(dá)，蛋白表達(dá)及活性調(diào)控，提示硫芥誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞凋亡依賴于Caspase-3途徑，探索尋找以Caspases蛋白酶為靶點的新藥合成作為硫芥中毒的早期防治可能具有一定的可行性。(3) 硫芥染毒前給予Caspase-3抑制劑四肽(Ac-DEVD-CHO)可干預(yù)硫芥誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞凋亡，使部分硫芥染毒淋巴細(xì)胞避免凋亡，從而減輕硫芥染毒淋巴細(xì)胞由于大量凋亡而導(dǎo)致的免疫功能低下或抑制，該結(jié)果提示以細(xì)胞凋亡信號通路中的關(guān)鍵性蛋白Caspases 家族為靶標(biāo)的多肽抑制劑具有一定的應(yīng)用價值。(4) 硫芥作用于淋巴細(xì)胞，可干擾細(xì)胞的生長周期，影響細(xì)胞周期的正常循環(huán)，造成細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞分裂增殖抑制，該作用可能是通過誘導(dǎo)凋亡途徑實現(xiàn)。(5) 大鼠硫芥中毒可造成機體免疫器官—脾臟損傷, 細(xì)胞凋亡是其作用機制之一。(6)硫芥染毒淋巴細(xì)胞線粒體跨膜電位顯著性下降，提示線粒體在硫芥誘發(fā)淋巴細(xì)胞凋亡過程中的重要作用， 硫芥誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡的信號傳導(dǎo)通路可能依賴于線粒體途徑(細(xì)胞外途徑)。 通過本課題多層次多途徑的檢測和研究，硫芥誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡的主要途徑可簡單歸納如下：硫芥染毒淋巴細(xì)胞→→線粒體改變，釋放凋亡相關(guān)的蛋白酶→→導(dǎo)致級聯(lián)反應(yīng)—"瀑布式"激活→→激活半胱氨酸蛋白酶家族凋亡效應(yīng)因子Caspase-3→→線粒體跨膜電位的的進(jìn)一步下降，各種凋亡信號形成正反饋放大效應(yīng)→→最終導(dǎo)致DNA斷裂，片段化→→細(xì)胞走向凋亡。
【圖文】：

a n = 5, * P 0.01 vs contro圖 4 硫芥(100μmol/L)染毒對淋巴細(xì)胞生長周期的環(huán)分別代表 control, 3h, 6h,9hFig 4 The changes of cell cycle of lymphocyte pr第二節(jié) 硫芥誘導(dǎo)離體淋巴細(xì)材料和一 主要試劑及藥品硫芥(純度為 97.5%) 軍RPMI1640 培養(yǎng)基 H

硫芥(100μmol/L)誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Caspase-3mRNA表達(dá)(Pv)(x__s)
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號】：R363

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本文編號：2628552