【摘要】：研究已證實神經(jīng)干細胞具有自我更新的能力及多向分化的潛能。不同細胞因子可影響神經(jīng)干細胞的增殖和分化過程。神經(jīng)干細胞分化的神經(jīng)元可以表達多種神經(jīng)遞質(zhì)，如GABA、P物質(zhì)、多巴胺等，然而在未加特殊誘導(dǎo)的情況下，絕大多數(shù)神經(jīng)干細胞自然分化成GABA能神經(jīng)元，自發(fā)分化為其他表型的神經(jīng)元非常罕見。許多研究表明通過調(diào)節(jié)細胞因子可以改變神經(jīng)干細胞的分化方向，將神經(jīng)干細胞誘導(dǎo)分化為某一特定類型的細胞。有人報道骨形態(tài)發(fā)生蛋白9(BMP9)可以通過誘導(dǎo)乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶和乙酰膽堿轉(zhuǎn)運囊基因的表達，而上調(diào)培養(yǎng)神經(jīng)細胞的乙酰膽堿的合成；腦室內(nèi)注射BMP9可增加活體動物腦組織內(nèi)的乙酰膽堿水平，認為BMP9是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的膽堿能分化因子。BMP家族中的BMP4是否具有對神經(jīng)干細胞的膽堿能誘導(dǎo)分化及上調(diào)神經(jīng)細胞的膽堿能表達作用，尚未見實驗報道。本實驗通過離體細胞培養(yǎng)及在體動物實驗了解BMP4是否具有上述作用。 首先，從2月齡SD大鼠海馬、紋狀體、第三腦室和側(cè)腦室的 碩士學(xué)位論文 成年大鼠腦神經(jīng)干細胞的分離培養(yǎng)與BMP4膽堿能誘導(dǎo)分化 VZ、SVZ區(qū)中分離出神經(jīng)干細胞。采用機械分散和化學(xué)消化法分離 出的細胞，用無血清培養(yǎng)液培養(yǎng);以Nestin、NF160和GFAP抗體作 為一抗，進行免疫細胞化學(xué)染色。結(jié)果顯示，在光學(xué)相差顯微鏡下見 培養(yǎng)的細胞具有神經(jīng)干細胞的形態(tài)特點和增殖特性;免疫細胞化學(xué)染 色見培養(yǎng)的細胞呈Nestin反應(yīng)陽性，NF 1 60、GFAP反應(yīng)陰性，即細 胞具備神經(jīng)干細胞的免疫學(xué)特性。 然后，將神經(jīng)干細胞的培養(yǎng)液中加入或不加入BMP4，，觀察其膽 堿能分化狀況。將培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞分成兩組，BMP4組改用加入 BMP4的誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng)，無BMP4組仍用原來的培養(yǎng)液培養(yǎng)作為對 照;培養(yǎng)8天后，對培養(yǎng)細胞分別行ChAI…抗體間接免疫熒光染色、 ChAT抗體和Nestin抗體SABC一DS雙標(biāo)免疫細胞化學(xué)染色及FITC標(biāo) 記的膽堿能流式細胞檢測。結(jié)果顯示BMP4組較多細胞發(fā)出較強的綠 色熒光，呈ChAT陽性;而無BMP4組較少的細胞發(fā)出較弱的ChAT 熒光。免疫雙標(biāo)細胞化學(xué)染色可見到三類細胞:一類為ChAT抗體反 應(yīng)陽性細胞，其細胞漿呈紫藍色，其中部分細胞呈典型的神經(jīng)元形態(tài) 特征;第二類為Nestin抗體反應(yīng)陽性細胞，其細胞漿呈紅色，細胞呈 圓形或前體樣細胞的形態(tài)，部分細胞處于分裂過程中;第三類為Nestin 和ChAI，抗體反應(yīng)陰性細胞，其細胞漿中未著色，細胞具有神經(jīng)元形 態(tài)特征。顯微鏡下計數(shù)，BMP4組的細胞中，ChAT反應(yīng)陽性的約占 28%，Nestin反應(yīng)陽性的約占38%;而無BMP4組的細胞中，Ch戶a， 反應(yīng)陽性的約為8%，Nestin反應(yīng)陽性的約為52%。流式細胞術(shù)檢測 BMP4組的ChAT陽性細胞率顯著高于二無BMP4組(16%、7%， P0 .05)。結(jié)果表明:BMP4對原代分離、體外培養(yǎng)的大鼠腦海馬及紋 狀體等區(qū)的神經(jīng)干細胞具有膽堿能分化誘導(dǎo)作用。 第三，將BMP4注入成年大鼠右側(cè)海馬齒狀回觀察其對神經(jīng)細胞 碩士學(xué)位論文 成年大鼠腦神經(jīng)干細胞的分離培養(yǎng)與BMP4膽堿能誘導(dǎo)分化 膽堿能表達的影響。將20只成年雄性SD大鼠隨機分成兩組:BMP4 組和鹽水對照組。麻醉后，采用立體定位技術(shù)將1風(fēng)BMP4(BMP4 組)或生理鹽水(對照組)注入大鼠右側(cè)海馬齒狀回區(qū)。14天后取腦， 石蠟包埋切片，行ChAT抗體免疫組化染色。用圖像分析系統(tǒng)計算大 鼠左右兩側(cè)海馬齒狀回的ChAT陽性細胞總面積，用51，Al’A 7.0軟件 進行t檢驗。結(jié)果顯示ChAT陽性神經(jīng)元在海馬CAI、CAZ、CA3及 齒狀回均有分布;BMP4組大鼠右側(cè)海馬齒狀回區(qū)Ch戶門尸陽性細胞面 積顯著高于左側(cè)(P0.01);而對照組大鼠左右兩側(cè)海馬齒狀回內(nèi) ChAT陽性細胞面積無顯著差異(P0.05)。兩組比較，BMP4組大鼠 右側(cè)海馬齒狀回內(nèi)ChAI…陽性細胞面積顯著高于對照組的相同部位 (P0.01);而兩組間左側(cè)海馬齒狀回內(nèi)ChAI，陽性細胞面積無顯著差 異(P.05)。結(jié)果提示，海馬齒狀回區(qū)接受BMP4注射后，可誘導(dǎo) 該區(qū)的細胞出現(xiàn)較高的膽堿能表達。 總之，本研究結(jié)果表明:(l)從成年大鼠海馬、紋狀體等區(qū)域可 分離出具有神經(jīng)干細胞形態(tài)學(xué)特征和免疫學(xué)特性的細胞;(2) BMP4 加入培養(yǎng)液中可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的成年大鼠腦海馬、紋狀體等區(qū)域神經(jīng) 干細胞的膽堿能分化;(3) BMP4注入海馬齒狀回可誘導(dǎo)成年大鼠該 區(qū)神經(jīng)元的膽堿能表達的上調(diào)。提示BMP家族中的BMP4具有誘導(dǎo) 神經(jīng)干細胞膽堿能分化或表達的效應(yīng)，值得在神經(jīng)退行性病變等疾病 的動物實驗及臨床治療中進行進一步的研究。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍醫(yī)進修學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號】：R329

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1 袁貴秀;李利文;鄒定全;江興華;王亞平;徐軍美;;骨形態(tài)發(fā)生蛋白及其受體在正常成年大鼠脊髓中的表達分布(英文)[J];中南大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2011年07期

2 姚愛華;徐為;艾凡榮;陳綺;王德平;黃文e

本文編號：2626396