【摘要】：研究已證實(shí)神經(jīng)干細(xì)胞具有自我更新的能力及多向分化的潛能。不同細(xì)胞因子可影響神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化過(guò)程。神經(jīng)干細(xì)胞分化的神經(jīng)元可以表達(dá)多種神經(jīng)遞質(zhì)，如GABA、P物質(zhì)、多巴胺等，然而在未加特殊誘導(dǎo)的情況下，絕大多數(shù)神經(jīng)干細(xì)胞自然分化成GABA能神經(jīng)元，自發(fā)分化為其他表型的神經(jīng)元非常罕見(jiàn)。許多研究表明通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子可以改變神經(jīng)干細(xì)胞的分化方向，將神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為某一特定類(lèi)型的細(xì)胞。有人報(bào)道骨形態(tài)發(fā)生蛋白9(BMP9)可以通過(guò)誘導(dǎo)乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶和乙酰膽堿轉(zhuǎn)運(yùn)囊基因的表達(dá)，而上調(diào)培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞的乙酰膽堿的合成；腦室內(nèi)注射BMP9可增加活體動(dòng)物腦組織內(nèi)的乙酰膽堿水平，認(rèn)為BMP9是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的膽堿能分化因子。BMP家族中的BMP4是否具有對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的膽堿能誘導(dǎo)分化及上調(diào)神經(jīng)細(xì)胞的膽堿能表達(dá)作用，尚未見(jiàn)實(shí)驗(yàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)離體細(xì)胞培養(yǎng)及在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)了解BMP4是否具有上述作用。 首先，從2月齡SD大鼠海馬、紋狀體、第三腦室和側(cè)腦室的 碩士學(xué)位論文 成年大鼠腦神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與BMP4膽堿能誘導(dǎo)分化 VZ、SVZ區(qū)中分離出神經(jīng)干細(xì)胞。采用機(jī)械分散和化學(xué)消化法分離 出的細(xì)胞，用無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng);以Nestin、NF160和GFAP抗體作 為一抗，進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色。結(jié)果顯示，在光學(xué)相差顯微鏡下見(jiàn) 培養(yǎng)的細(xì)胞具有神經(jīng)干細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)和增殖特性;免疫細(xì)胞化學(xué)染 色見(jiàn)培養(yǎng)的細(xì)胞呈Nestin反應(yīng)陽(yáng)性，NF 1 60、GFAP反應(yīng)陰性，即細(xì) 胞具備神經(jīng)干細(xì)胞的免疫學(xué)特性。 然后，將神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)液中加入或不加入BMP4，，觀察其膽 堿能分化狀況。將培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞分成兩組，BMP4組改用加入 BMP4的誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng)，無(wú)BMP4組仍用原來(lái)的培養(yǎng)液培養(yǎng)作為對(duì) 照;培養(yǎng)8天后，對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞分別行ChAI…抗體間接免疫熒光染色、 ChAT抗體和Nestin抗體SABC一DS雙標(biāo)免疫細(xì)胞化學(xué)染色及FITC標(biāo) 記的膽堿能流式細(xì)胞檢測(cè)。結(jié)果顯示BMP4組較多細(xì)胞發(fā)出較強(qiáng)的綠 色熒光，呈ChAT陽(yáng)性;而無(wú)BMP4組較少的細(xì)胞發(fā)出較弱的ChAT 熒光。免疫雙標(biāo)細(xì)胞化學(xué)染色可見(jiàn)到三類(lèi)細(xì)胞:一類(lèi)為ChAT抗體反 應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞，其細(xì)胞漿呈紫藍(lán)色，其中部分細(xì)胞呈典型的神經(jīng)元形態(tài) 特征;第二類(lèi)為Nestin抗體反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞，其細(xì)胞漿呈紅色，細(xì)胞呈 圓形或前體樣細(xì)胞的形態(tài)，部分細(xì)胞處于分裂過(guò)程中;第三類(lèi)為Nestin 和ChAI，抗體反應(yīng)陰性細(xì)胞，其細(xì)胞漿中未著色，細(xì)胞具有神經(jīng)元形 態(tài)特征。顯微鏡下計(jì)數(shù)，BMP4組的細(xì)胞中，ChAT反應(yīng)陽(yáng)性的約占 28%，Nestin反應(yīng)陽(yáng)性的約占38%;而無(wú)BMP4組的細(xì)胞中，Ch戶(hù)a， 反應(yīng)陽(yáng)性的約為8%，Nestin反應(yīng)陽(yáng)性的約為52%。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) BMP4組的ChAT陽(yáng)性細(xì)胞率顯著高于二無(wú)BMP4組(16%、7%， P0 .05)。結(jié)果表明:BMP4對(duì)原代分離、體外培養(yǎng)的大鼠腦海馬及紋 狀體等區(qū)的神經(jīng)干細(xì)胞具有膽堿能分化誘導(dǎo)作用。 第三，將BMP4注入成年大鼠右側(cè)海馬齒狀回觀察其對(duì)神經(jīng)細(xì)胞 碩士學(xué)位論文 成年大鼠腦神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與BMP4膽堿能誘導(dǎo)分化 膽堿能表達(dá)的影響。將20只成年雄性SD大鼠隨機(jī)分成兩組:BMP4 組和鹽水對(duì)照組。麻醉后，采用立體定位技術(shù)將1風(fēng)BMP4(BMP4 組)或生理鹽水(對(duì)照組)注入大鼠右側(cè)海馬齒狀回區(qū)。14天后取腦， 石蠟包埋切片，行ChAT抗體免疫組化染色。用圖像分析系統(tǒng)計(jì)算大 鼠左右兩側(cè)海馬齒狀回的ChAT陽(yáng)性細(xì)胞總面積，用51，Al’A 7.0軟件 進(jìn)行t檢驗(yàn)。結(jié)果顯示ChAT陽(yáng)性神經(jīng)元在海馬CAI、CAZ、CA3及 齒狀回均有分布;BMP4組大鼠右側(cè)海馬齒狀回區(qū)Ch戶(hù)門(mén)尸陽(yáng)性細(xì)胞面 積顯著高于左側(cè)(P0.01);而對(duì)照組大鼠左右兩側(cè)海馬齒狀回內(nèi) ChAT陽(yáng)性細(xì)胞面積無(wú)顯著差異(P0.05)。兩組比較，BMP4組大鼠 右側(cè)海馬齒狀回內(nèi)ChAI…陽(yáng)性細(xì)胞面積顯著高于對(duì)照組的相同部位 (P0.01);而兩組間左側(cè)海馬齒狀回內(nèi)ChAI，陽(yáng)性細(xì)胞面積無(wú)顯著差 異(P.05)。結(jié)果提示，海馬齒狀回區(qū)接受BMP4注射后，可誘導(dǎo) 該區(qū)的細(xì)胞出現(xiàn)較高的膽堿能表達(dá)。 總之，本研究結(jié)果表明:(l)從成年大鼠海馬、紋狀體等區(qū)域可 分離出具有神經(jīng)干細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征和免疫學(xué)特性的細(xì)胞;(2) BMP4 加入培養(yǎng)液中可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的成年大鼠腦海馬、紋狀體等區(qū)域神經(jīng) 干細(xì)胞的膽堿能分化;(3) BMP4注入海馬齒狀回可誘導(dǎo)成年大鼠該 區(qū)神經(jīng)元的膽堿能表達(dá)的上調(diào)。提示BMP家族中的BMP4具有誘導(dǎo) 神經(jīng)干細(xì)胞膽堿能分化或表達(dá)的效應(yīng)，值得在神經(jīng)退行性病變等疾病 的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床治療中進(jìn)行進(jìn)一步的研究。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類(lèi)號(hào)】：R329

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 袁貴秀;李利文;鄒定全;江興華;王亞平;徐軍美;;骨形態(tài)發(fā)生蛋白及其受體在正常成年大鼠脊髓中的表達(dá)分布(英文)[J];中南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2011年07期

2 姚愛(ài)華;徐為;艾凡榮;陳綺;王德平;黃文e

本文編號(hào)：2626396