【摘要】：目的 1、中華眼鏡蛇毒cystatin的分離并探討其體外抗腫瘤細(xì)胞侵襲的能力; 2、探討蛇毒cystatin合成基因在真核表達(dá)系統(tǒng)(COS7)中的表達(dá)。 方法 1、運(yùn)用親和層析、凝膠過(guò)濾等方法,從中華眼鏡蛇毒中分離出半胱氨酸蛋白酶抑制劑(cystatin);通過(guò)酶抑制動(dòng)力學(xué)、液相色譜分析、SDS-PAGE等方法鑒定其理化性質(zhì);并運(yùn)用體外重組基底膜實(shí)驗(yàn)分析蛇毒cystatin對(duì)B16小鼠黑色素瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。 2、根據(jù)中華眼鏡蛇毒cystatin蛋白的氨基酸序列合成cystatin基因的四個(gè)片段,通過(guò)緩慢退火PCR的方法將其拼接為完整的cystatin基因;PCR擴(kuò)增蛇毒cystatin基因;構(gòu)建攜帶蛇毒cystatin基因片段的真核表達(dá)載體;脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞;SDS-PAGE分析表達(dá)產(chǎn)物;ProBondTM蛋白純化系統(tǒng)純化融合蛋白,Western-blot鑒定。 結(jié)果 1、通過(guò)凝膠過(guò)濾、親和層析從中華眼鏡蛇毒中分離得到一小分子量半胱氨酸蛋白酶抑制劑(cystatin),經(jīng)酶抑制動(dòng)力學(xué)分析,該小分子半胱氨酸蛋白酶抑制劑具有明顯抑制木瓜蛋白酶(papain)的活性;經(jīng)高效液相色譜分析該活性物質(zhì)為單一組分。 2、該小分子cystatin在體外重組基底膜侵襲實(shí)驗(yàn)中具有抑制B16小鼠黑色素瘤細(xì)胞侵襲的能力。 WP=4 3、構(gòu)建了攜帶蛇毒cystatin基因片段的重組質(zhì)粒pcDNA3.1/His C-Cystatin,經(jīng)雙酶切鑒定和序列分析證實(shí)蛇毒cystatin基因已正確插入質(zhì)粒載體的多克隆位點(diǎn)。 4、經(jīng)SDS-PAGE分析表明轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的COS7細(xì)胞表達(dá)融合蛋白。該融合蛋白經(jīng)ProBondTM蛋白純化系統(tǒng)(Invitrogen公司)純化后,經(jīng)Western-blot鑒定其為蛇毒6×His-Cystatin融合蛋白,分子量為15000道爾頓,與融合蛋白的理論分子量相符。 結(jié)論 1、從中華眼鏡蛇毒中分離得到一種新的小分子量cystatin,它具有抑制B16腫瘤細(xì)胞體外侵襲的能力。 2、蛇毒cystatin重組蛋白在COS7細(xì)胞中表達(dá)并純化,為進(jìn)一步研究其生物學(xué)活性及抗腫瘤轉(zhuǎn)移功能奠定基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖 1-3 分子篩層析分離粗毒.1-3 Separation of crude venom by molecular sieve chromatograp層析子篩層析分離得到的具有抑制木瓜蛋白酶活性的洗脫峰 IV 上樣于pain-Sepharose4B 親和層析柱中，用0.05 mol/L Na3PO4緩沖液（pH 1l，以每管 2 ml 收集洗脫液，用紫外分光光度計(jì)在 260nm、280nm 下光值，繪制“洗脫體積—光密度值（OD280）”曲線，可以得到一個(gè)和洗脫峰（如圖 1-4 所示）。將該親和洗脫峰進(jìn)一步進(jìn)行酶抑制活力Elution volume(ml)

圖 2-1 質(zhì)粒 pcDNA3.1/His C 結(jié)構(gòu)示意圖Fig2-1 Map of pcDNA3.1/His C vectors 主要試劑和工具酶：DMEM 購(gòu)自美國(guó) Gibicol 公司，新生牛血清購(gòu)自杭州青公司，胰蛋白酶購(gòu)自上海生工生物工程公司。堿性磷酸酶（CIP）、限制切酶（XbaI ，KpnI）和 T4DNA 連接酶為 BioLab 公司產(chǎn)品。脂質(zhì)Lipofectamine 2000）和 Geneticin（G418）購(gòu)自美國(guó) Invitrogen 公司。PC盒購(gòu)自 Roche 公司。小量質(zhì)粒 DNA 提取純化試劑盒、膠回收試劑盒購(gòu)自中科開(kāi)瑞生物科技有限公司。ProBondTM蛋白純化試劑盒購(gòu)自 Invitrogen 公 引物：根據(jù) cystatin 基因序列、載體序列和不同的酶切位點(diǎn)，，應(yīng)用 VectorNT件分別設(shè)計(jì)上游和下游引物，由上海中科開(kāi)瑞生物公司合成。
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類(lèi)號(hào)】：R346

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前6條

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本文編號(hào)：2623299