【摘要】： 樹突狀細胞（Dendritic cells，DC）是近年來免疫學的研究熱點之一，從中 尋找新分子不僅有助于了解抗原提呈過程及免疫調(diào)節(jié)機制，而且可能有利于某些生 物學機制的探討。對cDNA文庫的隨機測序可以獲得新的分子，同時對這些新分 子的進一步功能研究將促進人們對某些生命現(xiàn)象的重新認識。本文所研究的hRabJ （human Rab protein with J domain）是從人DC的cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)的Rab家族的 新分子；而在此討論的mRabJ（mouse Rab protein with J domain）則是以小鼠睪丸 cDNA為模板克隆得到的hRabJ的小鼠同源物，與hRabJ在序列及生物學功能上具 有極大的相似性。Rab蛋白是一類屬于Ras超家族的小分子量GTP結合蛋白，自 身具有微弱的GTP酶活性，分子量在22—25KD之間。目前認為，通過GTP與GDP 的開關轉(zhuǎn)換作用發(fā)揮介導囊泡錨著與融合的功能，因此，對于蛋白的內(nèi)吞和外吐等 蛋白轉(zhuǎn)運過程發(fā)揮重要的調(diào)控功能。新的Rab分子的發(fā)現(xiàn)，必將有助于蛋白轉(zhuǎn)運 這一重要生物學現(xiàn)象的研究。 RabJ的EST是在對人DC cDNA文庫中大規(guī)模測序中發(fā)現(xiàn)的，，然后通過5' RACE獲得了全長基因的編碼序列。利用DC的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，我們克隆了RabJ 的全長cDNA（已經(jīng)在GenBank登錄，基因登錄號為AF178983），并將其用于以 后的載體克隆。hRabJ cDNA全長1787bp，開放閱讀框822bp，編碼273個氨基酸 的蛋白質(zhì)。同源搜索提示其含有兩類蛋白的特征性功能域。在其氨基端含有三個磷 酸/鎂離子結合基序和三個鳥苷酸結合功能域，是Rab蛋白家族分子結合GTP及發(fā) 揮GTP酶活性的保守結構；羧基端含一個70氨基酸殘基的J功能域，并且含有保 守的與Hsp70家族分子相互作用有關的HPD序列。因此，我們命名其為hRabJ （human Rab protein with J domain）。人類組織Northern印跡發(fā)現(xiàn)hRabJ優(yōu)勢表達于 睪丸組織，在卵巢和大腦中僅有極少量的表達，提示其可能參與生殖過程；在多種 細胞系內(nèi)我們檢測到了hRabJ RNA的少量表達。RT-PCR提示hRabJ廣泛低水平 表達于多種常見T淋巴細胞、B淋巴細胞及單核巨噬細胞系。由于hRabJ在睪丸組 織內(nèi)的高表達，我們用小鼠睪丸反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，以hRabJ的兩端引物為引物， 克隆得到了hRabJ的小鼠同源物，我們將其命名為mRabJ（mouse Rab protein with J domain）。hRabJ與mRabJ在蛋白水平上有97％的同源性。Northern印跡顯示mRabJ 也主要表達于睪丸組織，在小鼠的腦、心臟和骨骼肌中也檢測到少量的表達。為了 研究RabJ的功能，我們構建了多種原核及真核表達載體，包括GST融合表達載體、 氨基端和羧基端GFP融合表達載體以及無融合真核表達載體等多種載體。而且利 用pcDNA3.1-hRabJ中含有的新霉素選擇標記，我們篩選出了穩(wěn)定表達hRabJ的293 細胞株（hRabJ-293），并用于亞細胞分步裂解及共聚焦顯微鏡的定位研究。 首先我們利用GST原核蛋白表達系統(tǒng)，在大腸桿菌BL21內(nèi)表達并純化得到 Abstract 了 GST—hRabJ活性融合蛋白。用（aF‘勺 GTP作為標記，我們證明純化所得的融 合蛋白體外能夠特異結合GTP，該作用不能被小牛血清白蛋白（BSA人ATP所阻 斷，但是未標記的 GTP、GDP和 GTP類似物 GTP Y S可以阻斷這種結合作用；通 過檢測不同時間點的放射活性，我們得到T GST－bRabJ的 GTP動態(tài)結合曲線，證 明其最大結合能力約為 9 pmol／mg蛋白，稍高于其它已知的 Rab家族成員。用（Y－ P’勺 GTP為標記，我們得到7 hRabJ的酶活性曲線，與其它已知的 Rab家族成員類 似。 然后我們用純化所得GST．hRabJ蛋自多次免疫家兔，獲得了高親和力的抗體， 并利用野主型 BLZI裂解液及蛋白 A親和層析純化得到了特異性抗體。用 Western 蛋白印跡檢測，我們證明該抗體是特異的，在（hRabJ－293）中只有一條帶，可以 識別m RabJ，而且不與多種Rab家族分子及DnMSp40家族分子發(fā)主交叉反應； 用免疫熒光顯微鏡，在形態(tài)學上與GF P多抗所檢測的結果一致。利用該抗體，我 們檢測了hRabJ在細胞系及寒丸組織中的蛋自表達水平。結果提示，除了在暈丸組 織中有少量表達夕卜，各種細胞系中均未檢測到RabJ的表達。細胞內(nèi)熒光標記后FACS 檢測也沒有發(fā)現(xiàn)陽性表達的細胞系。為了研究＊勸J在睪丸組織內(nèi)的分布，利用間 接標記的免疫組織化學技術，我們發(fā)現(xiàn)二者在冰凍人與小鼠睪丸切片中均表達于生 精上皮細胞上，提示RabJ可能參與精子細胞的產(chǎn)生。因此，RabJ是一個優(yōu)勢表 達于睪丸組織的新型Rab分子。 Rab家族分子的一個非常顯著的特點是其分布的特異性，即每一個分子都具 有其各自的亞細胞分布，并在局部發(fā)揮蛋自轉(zhuǎn)運的功能。因此我們利用生物化學方 法及
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2001
【分類號】：R346

【共引文獻】

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本文編號：2598893