發(fā)布時(shí)間：2020-03-24 21:36

【摘要】： 樹(shù)突狀細(xì)胞（Dendritic cells，DC）是近年來(lái)免疫學(xué)的研究熱點(diǎn)之一，從中 尋找新分子不僅有助于了解抗原提呈過(guò)程及免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，而且可能有利于某些生 物學(xué)機(jī)制的探討。對(duì)cDNA文庫(kù)的隨機(jī)測(cè)序可以獲得新的分子，同時(shí)對(duì)這些新分 子的進(jìn)一步功能研究將促進(jìn)人們對(duì)某些生命現(xiàn)象的重新認(rèn)識(shí)。本文所研究的hRabJ （human Rab protein with J domain）是從人DC的cDNA文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)的Rab家族的 新分子；而在此討論的mRabJ（mouse Rab protein with J domain）則是以小鼠睪丸 cDNA為模板克隆得到的hRabJ的小鼠同源物，與hRabJ在序列及生物學(xué)功能上具 有極大的相似性。Rab蛋白是一類(lèi)屬于Ras超家族的小分子量GTP結(jié)合蛋白，自 身具有微弱的GTP酶活性，分子量在22—25KD之間。目前認(rèn)為，通過(guò)GTP與GDP 的開(kāi)關(guān)轉(zhuǎn)換作用發(fā)揮介導(dǎo)囊泡錨著與融合的功能，因此，對(duì)于蛋白的內(nèi)吞和外吐等 蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程發(fā)揮重要的調(diào)控功能。新的Rab分子的發(fā)現(xiàn)，必將有助于蛋白轉(zhuǎn)運(yùn) 這一重要生物學(xué)現(xiàn)象的研究。 RabJ的EST是在對(duì)人DC cDNA文庫(kù)中大規(guī)模測(cè)序中發(fā)現(xiàn)的，，然后通過(guò)5' RACE獲得了全長(zhǎng)基因的編碼序列。利用DC的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，我們克隆了RabJ 的全長(zhǎng)cDNA（已經(jīng)在GenBank登錄，基因登錄號(hào)為AF178983），并將其用于以 后的載體克隆。hRabJ cDNA全長(zhǎng)1787bp，開(kāi)放閱讀框822bp，編碼273個(gè)氨基酸 的蛋白質(zhì)。同源搜索提示其含有兩類(lèi)蛋白的特征性功能域。在其氨基端含有三個(gè)磷 酸/鎂離子結(jié)合基序和三個(gè)鳥(niǎo)苷酸結(jié)合功能域，是Rab蛋白家族分子結(jié)合GTP及發(fā) 揮GTP酶活性的保守結(jié)構(gòu)；羧基端含一個(gè)70氨基酸殘基的J功能域，并且含有保 守的與Hsp70家族分子相互作用有關(guān)的HPD序列。因此，我們命名其為hRabJ （human Rab protein with J domain）。人類(lèi)組織Northern印跡發(fā)現(xiàn)hRabJ優(yōu)勢(shì)表達(dá)于 睪丸組織，在卵巢和大腦中僅有極少量的表達(dá)，提示其可能參與生殖過(guò)程；在多種 細(xì)胞系內(nèi)我們檢測(cè)到了hRabJ RNA的少量表達(dá)。RT-PCR提示hRabJ廣泛低水平 表達(dá)于多種常見(jiàn)T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞及單核巨噬細(xì)胞系。由于hRabJ在睪丸組 織內(nèi)的高表達(dá)，我們用小鼠睪丸反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，以hRabJ的兩端引物為引物， 克隆得到了hRabJ的小鼠同源物，我們將其命名為mRabJ（mouse Rab protein with J domain）。hRabJ與mRabJ在蛋白水平上有97％的同源性。Northern印跡顯示mRabJ 也主要表達(dá)于睪丸組織，在小鼠的腦、心臟和骨骼肌中也檢測(cè)到少量的表達(dá)。為了 研究RabJ的功能，我們構(gòu)建了多種原核及真核表達(dá)載體，包括GST融合表達(dá)載體、 氨基端和羧基端GFP融合表達(dá)載體以及無(wú)融合真核表達(dá)載體等多種載體。而且利 用pcDNA3.1-hRabJ中含有的新霉素選擇標(biāo)記，我們篩選出了穩(wěn)定表達(dá)hRabJ的293 細(xì)胞株（hRabJ-293），并用于亞細(xì)胞分步裂解及共聚焦顯微鏡的定位研究。 首先我們利用GST原核蛋白表達(dá)系統(tǒng)，在大腸桿菌BL21內(nèi)表達(dá)并純化得到 Abstract 了 GST—hRabJ活性融合蛋白。用（aF‘勺 GTP作為標(biāo)記，我們證明純化所得的融 合蛋白體外能夠特異結(jié)合GTP，該作用不能被小牛血清白蛋白（BSA人ATP所阻 斷，但是未標(biāo)記的 GTP、GDP和 GTP類(lèi)似物 GTP Y S可以阻斷這種結(jié)合作用；通 過(guò)檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)的放射活性，我們得到T GST－bRabJ的 GTP動(dòng)態(tài)結(jié)合曲線，證 明其最大結(jié)合能力約為 9 pmol／mg蛋白，稍高于其它已知的 Rab家族成員。用（Y－ P’勺 GTP為標(biāo)記，我們得到7 hRabJ的酶活性曲線，與其它已知的 Rab家族成員類(lèi) 似。 然后我們用純化所得GST．hRabJ蛋自多次免疫家兔，獲得了高親和力的抗體， 并利用野主型 BLZI裂解液及蛋白 A親和層析純化得到了特異性抗體。用 Western 蛋白印跡檢測(cè)，我們證明該抗體是特異的，在（hRabJ－293）中只有一條帶，可以 識(shí)別m RabJ，而且不與多種Rab家族分子及DnMSp40家族分子發(fā)主交叉反應(yīng)； 用免疫熒光顯微鏡，在形態(tài)學(xué)上與GF P多抗所檢測(cè)的結(jié)果一致。利用該抗體，我 們檢測(cè)了hRabJ在細(xì)胞系及寒丸組織中的蛋自表達(dá)水平。結(jié)果提示，除了在暈丸組 織中有少量表達(dá)夕卜，各種細(xì)胞系中均未檢測(cè)到RabJ的表達(dá)。細(xì)胞內(nèi)熒光標(biāo)記后FACS 檢測(cè)也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞系。為了研究＊?jiǎng)馢在睪丸組織內(nèi)的分布，利用間 接標(biāo)記的免疫組織化學(xué)技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)二者在冰凍人與小鼠睪丸切片中均表達(dá)于生 精上皮細(xì)胞上，提示RabJ可能參與精子細(xì)胞的產(chǎn)生。因此，RabJ是一個(gè)優(yōu)勢(shì)表 達(dá)于睪丸組織的新型Rab分子。 Rab家族分子的一個(gè)非常顯著的特點(diǎn)是其分布的特異性，即每一個(gè)分子都具 有其各自的亞細(xì)胞分布，并在局部發(fā)揮蛋自轉(zhuǎn)運(yùn)的功能。因此我們利用生物化學(xué)方 法及
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2001
【分類(lèi)號(hào)】：R346

【共引文獻(xiàn)】

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1 李東至;熱休克蛋白與生殖[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(計(jì)劃生育分冊(cè));2001年03期

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本文編號(hào)：2598893