【摘要】： 間質(zhì)干細(xì)胞是成體干細(xì)胞的一種，它具有很強(qiáng)的自我增殖能力和多向分化潛能。大量研究表明，體外培養(yǎng)的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞在合適的誘導(dǎo)條件下，可分化為成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成肌細(xì)胞、成腱細(xì)胞和神經(jīng)元樣細(xì)胞等多種非造血組織特別是中胚層和神經(jīng)外胚層來(lái)源的組織細(xì)胞。骨髓間質(zhì)干細(xì)胞取材方便、易于在體外分離、純化，可在體內(nèi)外表達(dá)多種治療性的外源目的基因，因而近年來(lái)已成為基因和組織工程領(lǐng)域中研究的熱點(diǎn)。 本課題分離和純化了人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞，應(yīng)用實(shí)驗(yàn)血液學(xué)，免疫組織化學(xué)和分子生物學(xué)等方法，著重研究了人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的基本生物學(xué)特性，體外的增殖調(diào)控和成骨誘導(dǎo)，以及對(duì)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用于基因轉(zhuǎn)染領(lǐng)域的初步探討。主要結(jié)果如下： 1、人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的基本生物學(xué)特性 取胸部外科手術(shù)無(wú)血液系統(tǒng)疾病病人肋骨，采用密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞(淋巴細(xì)胞分離液密度為1.077)，以5×10~5/皿的細(xì)胞濃度接種，培養(yǎng)的MSCs貼壁后，細(xì)胞胞漿充盈，外形呈梭形，9天后瑞士-吉姆薩染色，可見(jiàn)由10個(gè)以上大小與形狀均一的細(xì)胞組成的集合，即間質(zhì)干細(xì)胞集落，如繼續(xù)培養(yǎng)，2周后，集落生成增大，并相互融合，形成融合層。當(dāng)MSCs生長(zhǎng)到亞融合狀態(tài)時(shí)，按1：3的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)，傳代2次后，MSCs達(dá)到純化。 選MSCs生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，測(cè)定細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。根據(jù)MSCs的 細(xì)胞生長(zhǎng)曲韓，利用公式計(jì)算MSCs的倍增時(shí)間為31．4 ，J。時(shí)。表面抗 原測(cè)定，MSCS CD45陰性，屬非造血組織細(xì)胞。 2、幾種因素對(duì)人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響 為了獲得大量的、狀態(tài)良好的MSCS應(yīng)用于基因轉(zhuǎn)染和組織工 程，本實(shí)驗(yàn)采用MSCs集落為檢測(cè)指標(biāo)，檢測(cè)了不同的血清濃度，不 同的細(xì)胞濃度，多種細(xì)胞因子和條件培養(yǎng)液對(duì)MSCS增殖的影響。結(jié) 果顯示： 不同濃度血清對(duì)MSCs集落生成的影響：在5浙30％的血清濃度 范圍內(nèi)，間質(zhì)干細(xì)胞集落的產(chǎn)率隨血清濃度的升高而增加，當(dāng)血清濃 度超過(guò)30％時(shí)，集落的產(chǎn)率不再增加。 不同細(xì)胞濃度對(duì)MSCS集落生成的影響：將純化的MSCS制成單 細(xì)胞懸液，按 200個(gè)／M和 500個(gè)／M的濃度分別接種 2組，每組7 M， 培養(yǎng)一段時(shí)間后每M隨機(jī)挑取5個(gè)集落，計(jì)數(shù)每個(gè)集落的細(xì)胞數(shù)。結(jié) 果：200個(gè)／M組，培養(yǎng)至第 9天時(shí)檢測(cè)，未見(jiàn)集落形成，在培養(yǎng)的 第13天檢測(cè)，可見(jiàn)集落形成，且細(xì)胞明顯老化，每個(gè)集落的細(xì)胞數(shù) 為 55．77土34．80；500個(gè)／皿組，養(yǎng)培 9天后己形成明顯的集落，每 個(gè)集落的細(xì)胞數(shù)為78．97士43．04。兩組細(xì)胞的倍增時(shí)間：200個(gè)／M 組為53．8小時(shí)；500個(gè)／皿組為34．3小時(shí)。 本實(shí)驗(yàn)狽定了幾一6（nng·＊廠‘），工一3（＊U·＊廣），工一1。 門0《m。工·1叫），＊＊（5＊·m＊），＊－＊F（工00＊·m＊），＊F 日 （Zng·m工），工＊Y（＊ng·m＊）等7禾因子對(duì)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞集 落生成的影響：工＊6（50ng·。＊），工－3（10U·m＊），＊肛（5＊·。＊） 三組與對(duì)照組才比均具有顯著性差異（p＜0．01），IL一IQ（10－’mol·1－‘） 組與對(duì)照組比較存在差異k．05L 這四種因子均可提高間質(zhì)干細(xì) 胞集落的產(chǎn)率，促進(jìn)間質(zhì)干細(xì)胞的增殖，其它三組州F－Y（25ng。1－‘人 GM－CSF（mong＠＊廣）和TGP－p（Zng·m＊‘）與對(duì)照組比較無(wú)明顯 差別（p＞0．05）。bFGF在3ng＠。＊－7ng＠。工 濃度范圍內(nèi)，bPG廠濃 度增加，間質(zhì)干細(xì)胞集落的生成也增加。與對(duì)照組比較， sns·M－‘，7us·覦‘組明顯促進(jìn)間質(zhì)干細(xì)胞集落的生成hu．01）， 7ng·mlrt組比 sng·ml＊組作用更強(qiáng)（P＜0．05）。bFGF濃度超過(guò) 7ng·ml‘ 時(shí)，對(duì)間質(zhì)干細(xì)胞集落的生成無(wú)明顯刺激作用。 MSC（M和 BRL（M對(duì)MSCS集落生成的影響：MSC｛M門0們 促進(jìn)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞集落的形成，與對(duì)照組比較有明顯差異 k①．05人BRL｛M門0們也促進(jìn)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞集落的形成，與對(duì) 照組比較，差異顯著ko．01人BRL｛M門0們對(duì)間質(zhì)干細(xì)胞增殖的 促進(jìn)作用比MSC－CM（107）更強(qiáng)b＜0．05）。 3、體外誘導(dǎo)人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化 體外培養(yǎng)MSCS至亞融合，加入成骨誘導(dǎo)劑繼續(xù)培養(yǎng)2周后，， 檢測(cè)堿性磷酸酶（AKP）的活性。結(jié)果顯示：誘導(dǎo)前，A肝活性呈 弱陽(yáng)性；誘導(dǎo)后，AKP活性呈強(qiáng)陽(yáng)性。在持續(xù)誘導(dǎo) 64周后，Von Kossa 染色鑒定礦化結(jié)節(jié)的產(chǎn)生，結(jié)果顯示：存在陽(yáng)性的黑色或深褐色的區(qū) 域，有礦化結(jié)節(jié)產(chǎn)生。說(shuō)明MSCS在體外誘導(dǎo)條件下，可表現(xiàn)出成骨 傾向。本實(shí)驗(yàn)己證實(shí)體外成骨誘導(dǎo)4周后的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞表達(dá) BMP－二基因。 且1互 4、人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞在基因轉(zhuǎn)染中的應(yīng)用 腺相關(guān)病毒（AAV）作為一種基因轉(zhuǎn)染的載體工具，擁有其他 轉(zhuǎn)染載體無(wú)可比擬的優(yōu)越性：對(duì)人體無(wú)毒性，無(wú)致瘤性。本實(shí)驗(yàn)采用 攜帶 GFP和 Neo”基因的 rAAV作為轉(zhuǎn)染載體，轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞MSCs。 結(jié)果顯示：MSCS可被AAV載體基因轉(zhuǎn)染，熒光顯微鏡下清晰可見(jiàn) 結(jié)構(gòu)明顯、帶有熒光的MSCS。
【圖文】：

圖1培養(yǎng)9天的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞集落(xloo)fig1.TheeolonyofMSCatgdayseulture.(XIOO)瓢翼鬢一圖2骨髓間質(zhì)干細(xì)胞融合層(x10

、袱氣矛夕沖李;;價(jià)i鉀)通矛舜?占;少咬長(zhǎng)滋‘尹尹、.伙價(jià)冬人‘.氛?qǐng)鼋橐凰鲍E布場(chǎng)毋軍Z寶澆之自鑲一擴(kuò)介姿獷了，火產(chǎn)、、賓‘今、七~伙論肇下圖1培養(yǎng)9天的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞集落(xloo)fig1.TheeolonyofMSCatgdayseulture.(XIOO)
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號(hào)】：R329.2

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 艾國(guó)平;粟永萍;冉新澤;劉曉宏;劉賢華;羅成基;程天民;;人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定[A];面向二十一世紀(jì)的生物醫(yī)學(xué)體視學(xué)和軍事病理學(xué)論文摘要匯編[C];2000年

2 李善宗;張成;陳國(guó)俊;吳金浪;肖慶忠;李樹(shù)濃;;體外培養(yǎng)大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第七次全國(guó)神經(jīng)病學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2004年

3 李中;張成;陳國(guó)俊;劉曉蓉;;骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植治療DMD模型鼠后運(yùn)動(dòng)功能的改善[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第七次全國(guó)神經(jīng)病學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2004年

4 廖威明;梁海翔;郭小荑;雷磊;牛會(huì)林;溫醒偉;;異體骨結(jié)合骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植治療骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究[A];中國(guó)康復(fù)醫(yī)學(xué)會(huì)修復(fù)重建外科專業(yè)委員會(huì)第十四次全國(guó)學(xué)術(shù)交流會(huì)論文集[C];2004年

5 張化彪;丁新生;;大鼠腦出血后骨髓間質(zhì)干細(xì)胞治療作用的實(shí)驗(yàn)研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第七次全國(guó)神經(jīng)病學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2004年

6 李善宗;張成;陳國(guó)俊;李群;肖慶忠;李樹(shù)濃;吳金浪;;體外培養(yǎng)誘導(dǎo)大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞分化為肌樣細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第七次全國(guó)神經(jīng)病學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2004年

7 龍劍虹;祁敏;;以骨髓間質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)肌腱缺損的實(shí)驗(yàn)研究[A];2005'中國(guó)修復(fù)重建外科論壇論文匯編[C];2005年

8 吳江;曹慧;陳槐卿;張立;K-L Paul Sung;;鈦顆粒負(fù)荷對(duì)切應(yīng)力作用下骨髓間質(zhì)干細(xì)胞F-actin表達(dá)和DNA含量的影響[A];中國(guó)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)會(huì)第六次會(huì)員代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要匯編[C];2004年

9 李中;張成;陳國(guó)俊;劉曉蓉;;骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植治療dko鼠后肌組織的超微結(jié)構(gòu)改變[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第七次全國(guó)神經(jīng)病學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2004年

10 吳江;曹慧;陳槐卿;張立;K-LPaulSung;;鈦顆粒負(fù)荷對(duì)切應(yīng)力作用下骨髓間質(zhì)干細(xì)胞F-actin表達(dá)和DNA含量的影響[A];中國(guó)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)會(huì)第六次會(huì)員代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要匯編[C];2004年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前4條

1 李連達(dá);張榮利;骨髓干細(xì)胞移植能不能治冠心��？[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2004年

2 ;骨髓干細(xì)胞移植治療冠心病的爭(zhēng)論[N];中國(guó)中醫(yī)藥報(bào);2005年

3 高沖;克隆器官何時(shí)造福人類[N];中國(guó)稅務(wù)報(bào);2001年

4 新華;骨髓干細(xì)胞可修復(fù)心臟損傷[N];保健時(shí)報(bào);2003年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前4條

1 趙宗茂;RANKL對(duì)成人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化的影響研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2003年

2 許文榮;骨髓間質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化及致瘤特性研究[D];南京師范大學(xué);2004年

3 楊立信;骨髓間質(zhì)干細(xì)胞構(gòu)建組織工程心臟瓣膜的實(shí)驗(yàn)研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2004年

4 江遜;定向誘導(dǎo)人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞為軟骨細(xì)胞及構(gòu)建組織工程化軟骨的初步研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2002年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 雷軍;人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特征和體外成骨分化的研究[D];中南大學(xué);2003年

2 鄭奇軍;5-氮雜胞苷誘導(dǎo)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞定向心肌樣分化的實(shí)驗(yàn)研究[D];中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué);2003年

3 段紅艷;大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究[D];鄭州大學(xué);2003年

4 趙健;大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞在心肌梗死及心力衰竭中應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)研究[D];鄭州大學(xué);2004年

5 曹慧;鈦顆粒負(fù)荷對(duì)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞增殖及成骨分化的影響[D];四川大學(xué);2004年

6 余良宏;大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞靜脈移植在脊髓損傷修復(fù)中的作用實(shí)驗(yàn)研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2004年

7 張薇;兔骨髓間質(zhì)干細(xì)胞在體外正常及病理心肌細(xì)胞微環(huán)境中的定向分化[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2004年

8 欒波;體外心肌細(xì)胞微環(huán)境下骨髓間質(zhì)干細(xì)胞定向分化的實(shí)驗(yàn)研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2002年

9 黃麗;硝酸甘油通過(guò)一氧化氮途徑促進(jìn)人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞增殖及向成骨細(xì)胞分化[D];中南大學(xué);2007年

10 周進(jìn)明;小鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)性狀及應(yīng)用可行性研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2001年

本文編號(hào)：2592131