發(fā)布時間：2020-03-20 18:57

【摘要】：Tat蛋白是人免疫缺陷病毒HIV-1基因編碼的一個反式作用激活因子，它能增強(qiáng)HIV-1基因轉(zhuǎn)錄的起始和延伸的效率；同時它還可能在AIDS病的發(fā)病過程中起著重要作用。因此，Tat蛋白是一個理想的抗HIV-1感染作用的靶子。Tat的順式作用應(yīng)答元件TAR RNA是指HIV-1轉(zhuǎn)錄子5′端的前60個核苷酸，它具有典型的“莖-環(huán)”二級結(jié)構(gòu)。由于Tat發(fā)揮功能需要直接或間接地結(jié)合于TAR RNA的“泡”狀結(jié)構(gòu)上，因此TAR也是一個理想的抗HIV-1感染作用的靶子。本實驗室已進(jìn)行的研究表明，HIV-1 LTR跨-158到+80的片段，稱之為YL158，具有比全長LTR及其它不同缺失突變的LTR片段強(qiáng)得多的啟動子活性；并且YL158含有TAR DNA序列，可以受到HIV-1 Tat的調(diào)控。本研究中用這一片段作為表達(dá)外源抗性基因的啟動子。 現(xiàn)有的突變分析結(jié)果表明，HIV-1 Tat蛋白具有幾個重要的功能域，并且在不同免疫缺陷病毒(HIV-1，HIV-2和SW)的Tat中均具有三個高度保守的功能域：Cys富集域、核心域和堿性氨基酸富集域。我們用PCR定點(diǎn)突變的方法在HIV-1 Tat蛋白的這些區(qū)域引入單氨基酸或多氨基酸突變；構(gòu)建了以HIV-1 LTR YL158片段為啟動子，含有不同突變點(diǎn)的突變tat基因表達(dá)質(zhì)粒；以熒光酶基因為報告基因，通過瞬時共轉(zhuǎn)染Jurkat T淋巴細(xì)胞；分析了不同氨基酸突變對Tat蛋白的反式激活作用的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，突變后Tat蛋白的活性均極大地降低或喪失，表明這些序列內(nèi)的氨基酸的確定性對Tat蛋白的功能至關(guān)重要。同時，根據(jù)Brookhaven PDB中的HIV-1 Tat蛋白的NMR數(shù)據(jù)，模擬出了野生型Tat蛋白的三維空間結(jié)構(gòu)。應(yīng)用Biosym公司的INSIGHT Ⅱ軟件包，分析了不同的氨基酸替換對Tat蛋白高級結(jié)構(gòu)的影響；結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Tat蛋白保守序列中氨基酸的替換造成的活性改變與其三維結(jié)構(gòu)的變化間有較贏的相關(guān)性。 為了尋找能有效地控制HIV-1感染的途徑，，我們設(shè)計了一系列抗HIV-1感染的抗性基因，并第一次提出用反義多聚TAR-Core RNA作為一種新的抗HIV-1基因表達(dá)的策略。通過自己建立的“自身引物—模板PCR”的方法，得到了含有TAR核心序列[+13到+47]的多聚TAR-Core DNA同向串聯(lián)
【學(xué)位授予單位】：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：1997
【分類號】：R373

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2592047