【摘要】：間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)起源于中胚層，主要位于成體骨髓和人胎兒臍血，與造血干細(xì)胞共存。MSC不僅參與構(gòu)建造血微環(huán)境，發(fā)揮支持造血的作用；而且在動(dòng)物出生后仍然維持一定程度的自我更新能力，以及具有分化為多種類(lèi)型細(xì)胞的潛力，屬于成體多能干細(xì)胞范疇。 自1867年Cohnheim首次提出骨髓基質(zhì)中含有非造血干細(xì)胞，以及1976年Friedenstein用貼壁法粗糙提取出骨髓中該種細(xì)胞成分以來(lái)，多個(gè)實(shí)驗(yàn)在含動(dòng)物血清的培養(yǎng)基中建立了穩(wěn)定擴(kuò)增的骨髓MSC細(xì)胞培養(yǎng)體系。2000年，Erices從人臍血中也分離出MSC，建立起與骨髓MSC類(lèi)似的髓外來(lái)源MSC的細(xì)胞培養(yǎng)。近來(lái)研究表明，骨髓和髓外來(lái)源的MSC在體內(nèi)外誘導(dǎo)條件下，不僅能夠分化為骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、腱細(xì)胞、肌細(xì)胞等中胚層細(xì)胞，而且可以跨越胚層的限制，橫向分化(TD)為外胚層起源的神經(jīng)元。MSC向神經(jīng)元的誘導(dǎo)分化，有Sanchez-Ramos建立的以生長(zhǎng)／營(yíng)養(yǎng)因子為主的模式，和Woodbury建立的有機(jī)誘變劑(抗氧化劑)為主的方案。誘導(dǎo)后的MSC可檢測(cè)出nestin，trkA，NSE，NeuN，NF-M，tau等多種神經(jīng)元／神經(jīng)干細(xì)胞特異性蛋白的表達(dá)。 本實(shí)驗(yàn)分離及培養(yǎng)了人臍血和兔骨髓兩種來(lái)源的MSC，觀察細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇，以及貼壁、生長(zhǎng)與擴(kuò)增規(guī)律，并使用MTT比色實(shí)驗(yàn)繪制不同狀態(tài)MSC的生長(zhǎng)曲線。采用調(diào)整的Woodbury方案，即β-巰基乙醇(BME)低劑量(≤3mM)、短時(shí)程(≤2h)誘導(dǎo)兔骨髓MSC向神經(jīng)元分化，并在誘導(dǎo)后繼續(xù)培養(yǎng)，免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定誘導(dǎo)分化和分化后培養(yǎng)細(xì)胞的陽(yáng)性率。嘗試使用膜片箝全細(xì)胞記錄的方法記錄誘導(dǎo)前后MSC的鉀離子電流的變化，以反映細(xì)胞的電生理功能 鄭州大學(xué)20(抖年碩士研究生學(xué)位論文 間充質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)及向神經(jīng)元的誘導(dǎo)分化 狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用“均數(shù)”或者“均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差”表示，樣本間比較采用方差分析， 檢驗(yàn)水準(zhǔn)均為a=0 .050 結(jié)果顯示:1人臍血MSC體外培養(yǎng)呈現(xiàn)細(xì)胞的多樣性，未形成融合狀態(tài)， 不能連續(xù)多次傳代(傳代蕊3)。兔骨髓MSC在3w左右建立穩(wěn)定擴(kuò)增的原代培 養(yǎng)，細(xì)胞形態(tài)均一，排列有序，體外培養(yǎng)16代以上無(wú)變化。2細(xì)胞經(jīng)過(guò)多次傳 代，MTT比色實(shí)驗(yàn)證實(shí)生長(zhǎng)特性不變，功.05);凍存后復(fù)蘇細(xì)胞的擴(kuò)增暫時(shí)減 慢，傳代后恢復(fù)。3向神經(jīng)元誘導(dǎo)分化后，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示:兔骨髓 MSC表達(dá)NSE以及nestin，其陽(yáng)性率分別為70嘆產(chǎn)73%和37%~38%，與對(duì)照組 相比有顯著差異(廠0.05)。繼續(xù)培養(yǎng)，陽(yáng)性細(xì)胞率無(wú)明顯變化，閉.05)。4誘 導(dǎo)前后的兔骨髓MSC直接貼附于底面或者貼附于賴氨酸處理的底面，一定時(shí)段 內(nèi)，能夠與微電極尖端形成高阻封接(giga-sealing)，提示可進(jìn)行全細(xì)胞記錄， 為進(jìn)一步的離子通道的檢測(cè)提供基礎(chǔ).但目前尚未記錄到離子電流的活動(dòng)。 結(jié)論:1.兔骨髓MSC能夠建立穩(wěn)定的連續(xù)傳代的體外培養(yǎng)，凍存后復(fù)蘇的 細(xì)胞形態(tài)和特性不變。人臍血中含MSC，有可能建立同樣的培養(yǎng).2.兔骨髓 MSC經(jīng)BME誘導(dǎo)可表達(dá)nestin和NSE;誘導(dǎo)后的MSC(神經(jīng)干細(xì)腳神經(jīng)元) 在神經(jīng)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，存活且分子標(biāo)志的表達(dá)無(wú)增減。3.在本實(shí)驗(yàn)條件下， 體外培養(yǎng)的兔骨髓MSC誘導(dǎo)前后，，均未記錄到電流活動(dòng)。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類(lèi)號(hào)】：R329.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2591664