【摘要】：目的: 采用基因工程技術(shù)大量表達重組幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,H.pylori)細胞空泡毒素(vacuolatingcytotoxin A ,VacA)的毒性片段,用此重組蛋白作為抗原,制備高效價的抗 VacA 的雞蛋黃抗體 IgY,為研制 H.pylori 治療性抗體制劑奠定基礎(chǔ)。 方法:通過大量培養(yǎng)并誘導(dǎo)重組菌 pQE30-v-DH5a,獲得重組蛋白VacA。Ni2+-NTA 樹脂純化后,Bradford 法測定蛋白濃度。用該重組蛋白免疫雞,制備抗 VacA 的雞卵黃抗體(VacA-IgY)。用重組蛋白建立檢測人血清 VacA 抗體的間接 ELISA 法,評價其抗原性。以 Helico Blot試劑盒檢測結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn),評價所建立的 ELISA 的特異性和敏感性。用重組蛋白建立檢測 VacA-IgY 的間接 ELISA 法,評價重組蛋白的免疫原性。用建立的檢測 VacA-IgY 的 ELISA 法測定 IgY 產(chǎn)生的時間-抗體效價變化情況。收集不同免疫時間的 VacA-IgY,混合后用硫酸銨沉淀法純化濃縮,SDS-PAGE 分析其純度。間接 ELISA 法檢測純化抗體的效價,Bradford 法測定蛋白含量。 結(jié)果: 1.目的蛋白主要以包涵體形式表達,經(jīng) NI2+-NTA 柱純化,純度 90%,Bradford 法測得蛋白質(zhì)含量為 0.67mg/mL; 2. 所建立的檢測人血清VacA抗體間接ELISA法特異性和靈敏度分別為92.0%和92.3%。重組蛋白可被病人血清所識別;3.檢測 VacA-IgY 的 ELISA 法表明 重組蛋白免疫雞后的雞蛋黃提取物可與該重組蛋白發(fā)生反應(yīng) ；4.重組 蛋白免疫雞后 100 天可獲得高效價（1：6400）的 IgY；5.飽和硫酸銨 沉淀法純化濃縮后，可獲得純度 65％左右的 IgY，效價高達 1：12800 （ELISA 法），蛋白濃度為 25.66mg/mL（Bradford 法）。 結(jié)論：1.制備的重組蛋白具有良好的抗原性和免疫原性；2.制備 了高濃度、高效價、較高純度的 VacA-IgY；3.建立了檢測人血清 VacA 抗體的間接 ELISA 法，，特異性和靈敏度分別為 92.0％和 92.3％；4.建 立了檢測蛋黃提取物中 VacA-IgY 的間接 ELISA 法。
【圖文】：

圖 1-1 重組蛋白表達形式的鑒定Fig 1-1 The identification of the expression form of recombinant protein marker； 2. pQE30-V induced without IPTG； 3. supernatant of pQE30-V inTG； 4. precipitation of pQE30-V induced with IPTG白包涵體的純化破碎菌的沉淀洗滌后變性溶解，以 NI2＋-NTA 柱純化，經(jīng) SDS-PA，純化產(chǎn)物主要存在于前 3 管洗脫液中，純度為 90%，見圖 1-2

圖 1-1 重組蛋白表達形式的鑒定 1-1 The identification of the expression form ofer； 2. pQE30-V induced without IPTG； 3. sup 4. precipitation of pQE30-V induced with IPTG涵體的純化菌的沉淀洗滌后變性溶解，以 NI2＋-NTA 化產(chǎn)物主要存在于前 3 管洗脫液中，純
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2005
【分類號】：R392

【共引文獻】

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本文編號：2583100