【摘要】： 本論文主要探索性的研究了接頭蛋白NRBP (nuclear receptor binding protein)和蛋白酶caspase-10g的結(jié)構(gòu)和功能,分別揭示了它們?cè)诩?xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路AP-1、NF-κB及細(xì)胞凋亡通路中可能的作用機(jī)制。 NRBP是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的接頭蛋白(adapter protein),由535個(gè)氨基酸構(gòu)成,擁有結(jié)合SH2的結(jié)構(gòu)域,核受體結(jié)合域,核輸出信號(hào)和核定位信號(hào)。目前關(guān)于它的功能研究并不多,然而已有的結(jié)構(gòu)域提示其可能在多個(gè)細(xì)胞信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用。我們首先應(yīng)用酵母雙雜交方法篩選得到NRBP的結(jié)合蛋白Jab1(Jun activating binding protein 1),進(jìn)一步的免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了兩者在生理?xiàng)l件下相互作用。 Jab1是COP9復(fù)合物的第五亞基,能夠通過(guò)與c-Jun的結(jié)合,誘導(dǎo)c-Jun的磷酸化,即而激活轉(zhuǎn)錄因子AP-1信號(hào)通路。本研究運(yùn)用熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)方法及免疫印跡方法,發(fā)現(xiàn)NRBP顯著抑制Jab1誘導(dǎo)的c-Jun的磷酸化及轉(zhuǎn)錄因子AP-1的活性。過(guò)表達(dá)NRBP特異性的顯著抑制PMA或T細(xì)胞受體(TCR)激活的AP-1活性,活化T細(xì)胞核因子(NFAT)與AP-1經(jīng)常通過(guò)協(xié)同作用共同調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄,過(guò)表達(dá)NRBP也顯著抑制了T細(xì)胞中PMA/Ionomycin或TCR激活的轉(zhuǎn)錄因子NFAT活性,但不影響PMA或TCR誘導(dǎo)的CD69蛋白(T細(xì)胞活化表面標(biāo)記蛋白)的表達(dá),提示NRBP可能通過(guò)與Jab1的結(jié)合,在TCR通路的下游行使負(fù)調(diào)控作用。 綜合以上研究結(jié)果說(shuō)明,NRBP能夠特異性的負(fù)調(diào)控Jab1的轉(zhuǎn)錄激活功能,并可能是T細(xì)胞活化的負(fù)調(diào)控因子。這一新的發(fā)現(xiàn)為最終全面揭示NRBP在AP-1等細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。 Caspase-10是死亡受體介導(dǎo)的凋亡途徑中重要的啟動(dòng)型caspase。目前已知caspase-10具有六個(gè)不同的剪切體(caspase-10a～f)。本論文的另一研究主要運(yùn)用生物信息學(xué)及分子生物學(xué)方法,成功預(yù)測(cè)并克隆到一個(gè)caspase-10新剪切體,命名為caspase-10g,并對(duì)其功能進(jìn)行了研究。 Caspase-10g蛋白由247個(gè)氨基酸組成,它只含有死亡結(jié)構(gòu)域組成的原結(jié)構(gòu)域(prodomain),而不含有催化域。Caspase-10g基因在caspase-10基因第五和第六外顯子之間擁有一個(gè)獨(dú)有的外顯子,造成蛋白產(chǎn)物在原結(jié)構(gòu)域后很快終止。應(yīng)用RT-PCR技術(shù),我們檢測(cè)到caspase-10g廣泛存在于人的正常組織中,并且在幾種腫瘤細(xì)胞株中也有表達(dá)。更進(jìn)一步的免疫印跡實(shí)驗(yàn)證實(shí),在腫瘤細(xì)胞HeLa及Jurkat中存在內(nèi)源的caspase-10g蛋白。 應(yīng)用熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)體系,我們發(fā)現(xiàn)caspase-10g顯著激活核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活性,并且這種作用表現(xiàn)出劑量依賴性效應(yīng)和時(shí)間依賴性效應(yīng)。接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)顯示,作為只含有原結(jié)構(gòu)域的剪切體,caspase-10g激活NF-κB的能力要遠(yuǎn)大于含有完整催化域的剪切體caspase-10a。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)提示過(guò)表達(dá)caspase-10g能夠輕度誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,然而這種能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于含有完整催化域的剪切體caspase- 10a。本研究的意義在于發(fā)現(xiàn)了只含有原結(jié)構(gòu)域的新剪切體caspase-10g,caspase-10g具有顯著激活NF-κB活性的特性,其誘導(dǎo)凋亡的能力稍低,這提示其很可能在凋亡的信號(hào)通路中起著復(fù)雜的調(diào)控平衡作用,后續(xù)研究將有助于將其作為治療腫瘤及免疫疾病的靶點(diǎn)。
【圖文】：

12圖1-1.NRBP激酶樣結(jié)構(gòu)域與幾個(gè)已知激酶的結(jié)構(gòu)域序列比對(duì)Figure 1-1．Multiple sequence alignment. Kinase subdomains are indicated at the top. Eachsubdomain consensus is indicated at the bottom, and highly conserved residues are underlined鼠類中存在與人 NRBP 高度同源的蛋白 MADM，，它與骨髓白血病因子 Mlf1及 14-3-3ζ形成復(fù)合物，Mlf1 具有 14-3-3 結(jié)合序列 RSXSXP，MADM 可能介導(dǎo)了該結(jié)合序列的磷酸化，使 Mlf1 與 14-3-3ζ的結(jié)合更牢固[6]。MADM 與 NRBP一樣缺少 ATP 結(jié)合位點(diǎn)及相應(yīng)的激酶保守位點(diǎn)，它本身不能行使激酶功能，因

圖1-2 Jab1調(diào)節(jié)AP-1轉(zhuǎn)錄活性的模式圖Figure 1-2. Model of Jab1 function in regulating AP-1 mediated transcription.．轉(zhuǎn)錄因子 AP-1真核細(xì)胞中已發(fā)現(xiàn)多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子及 DNA 結(jié)合蛋白，它們通過(guò)結(jié)合到目因特定的 DNA 調(diào)節(jié)區(qū)域來(lái)調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄因子 AP-1（activatrotein 1）是堿性亮氨酸拉鏈蛋白(bZIP:basic leucine-zipper protein JUN，F(xiàn)OS，ATF (activating transcription factor)及 MAF (musculoapeurotic fibrosarcoma)蛋白家族成員通過(guò)亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域組成，不同的二聚體及異源二聚體形式調(diào)控不同的目的基因[31]。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中P-1 蛋白主要是 FOS 和 JUN，它們識(shí)別特異的 DNA 反應(yīng)元件 TRE(Tesponsive element)，此元件最初是在金屬硫蛋白 I(metallothionein I)
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R341

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前3條

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2 秦治翔;擬南芥1，3，4-三磷酸肌醇5/6-激酶在光形態(tài)建成中的功能研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

3 梁佩燕;HIV-1和SIV nef基因表達(dá)對(duì)T淋巴細(xì)胞系功能及蛋白譜改變的比較作用研究[D];暨南大學(xué);2008年

本文編號(hào)：2582863