【摘要】： Pokemon分子在人類腫瘤如T、B細(xì)胞淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌和膀胱癌等疾病的腫瘤中異常高表達(dá),被直接證明是腫瘤發(fā)生的一個(gè)關(guān)鍵因素。POK蛋白家族成員在胚胎發(fā)育分化和致瘤中也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。Pokemon (POK細(xì)胞髓樣發(fā)生因子,亦稱為L(zhǎng)RF, OCZF和FBI-1 )是POK蛋白家族成員,由Zbtb7基因編碼,在細(xì)胞分化中作用居多并且自身能夠影響其它的POK家族成員。缺失Zbtb7基因的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞對(duì)其它原癌基因(如E1A、Ras、Myc和T-Ag等)介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化完全無反應(yīng);在轉(zhuǎn)基因小鼠模型中Pokemon的過表達(dá)導(dǎo)致了腫瘤的發(fā)生,并且證明了它是通過直接結(jié)合而特異地抑制腫瘤抑制基因ARF的轉(zhuǎn)錄。Pokemon基因的作用模式為:Pokemon↑↑→ARF↓→MDM2→p53↓→腫瘤發(fā)生。因此,以Pokemon基因?yàn)榘袠?biāo)的腫瘤基因治療具有十分重要的意義。 為解決靶向沉默Pokemon基因來治療腫瘤的問題,我們借鑒了近幾年來出現(xiàn)的有關(guān)RNA干擾(RNA interference, RNAi )的實(shí)驗(yàn)研究。RNAi是出現(xiàn)在多種生物體內(nèi)、進(jìn)化上高度保守的一種基因保護(hù)機(jī)制,被稱為“基因組的免疫系統(tǒng)”。其基本作用途徑為:長(zhǎng)dsRNA被具有RNaseIII活性的Dicer復(fù)合體切割成21-23bp的小雙鏈RNA或稱為小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA),siRNA的負(fù)鏈與其它多種成分組成RISC (RNA- induced silencing complex),最后通過堿基配對(duì)的方式觸發(fā)同源mRNA的特異性降解。現(xiàn)在,siRNA已經(jīng)成為應(yīng)用于臨床疾病防治研究的有力工具。已經(jīng)證實(shí),siRNA對(duì)HBV、HIV等病毒和前列腺癌、白血病等腫瘤細(xì)胞基因都有很好的沉默作用。這些都為本課題研究將RNAi應(yīng)用到腫瘤的基因治療領(lǐng)域提供了理論依據(jù)。 基于此,本研究利用RNAi技術(shù)對(duì)Pokemon基因表達(dá)進(jìn)行抑制以達(dá)到治療腫瘤的目的,進(jìn)行了以下研究: 1、針對(duì)Pokemon基因的siRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 (1)設(shè)計(jì)針對(duì)Pokemon基因的靶序列:利用美國(guó)著名RNA產(chǎn)品公司Ambion提供的網(wǎng)上在線設(shè)計(jì)工具,記錄每個(gè)AA的3’-端19個(gè)氨基酸作為潛在siRNA靶位點(diǎn)。潛在靶位點(diǎn)通過BLAST分析,去除同源性的靶序列,選擇GC含量在40-55%的靶位點(diǎn)
【圖文】：

化學(xué)合成了 4 對(duì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈，將其定向克隆入 pSilencer 5.1-H1 Retro 載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 E.coli。然后經(jīng)過酶切鑒定和測(cè)序來驗(yàn)證構(gòu)建是否成功。實(shí)驗(yàn)材料及儀器一、實(shí)驗(yàn)材料設(shè)計(jì)的 siRNAs DNA 編碼序列由 Takara 公司合成，DNA ligation kit Ver2.0、BamHI和 HindIII 限制性核酸內(nèi)切酶等均購(gòu)于 Takara 公司，pSilencerTM5.1-H1 Retro 試劑盒購(gòu)于 Ambion 公司，該質(zhì)粒環(huán)形圖譜如圖 1 所示。大腸桿菌感受態(tài) DH5α 為本教研室制備保存株，，DMSO 法制備感受態(tài)細(xì)菌所需的試劑均為國(guó)產(chǎn)試劑，質(zhì)粒抽提試劑盒為Omega 公司的 E.Z.N.A Plasmid Maxiprep kit (D6922-01)，分子量標(biāo)準(zhǔn) Marker III 和DL2000 均購(gòu)于北京天為時(shí)代科技有限公司，重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體送上海英駿（Invitrogen）生物技術(shù)有限公司（原上海博亞生物技術(shù)有限公司）測(cè)序。

圖 5-1 psiRNA-1 插入片段的測(cè)序結(jié)果Figure5-1．Sequencing result of the insert fragment in the psiRNA-1圖 5-2 psiRNA-2 插入片段的測(cè)序結(jié)果Figure5-2．Sequencing result of the insert fragment in the psiRNA-2
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2582552