【摘要】： 李斯特菌是一種分布非常廣泛的革蘭氏陽性兼性胞內(nèi)細(xì)菌,在絕大多數(shù)食品中都存在。李斯特菌可引起嚴(yán)重的血液和腦組織感染。毒力因子的研究對于了解它的致病機(jī)制以及快速診斷均具有重要意義。iap (invasion associated protein)基因編碼的p60蛋白是由李斯特菌產(chǎn)生的胞外蛋白,它對于該菌的分裂必不可少,并與該菌的侵襲性密切相關(guān)。在李斯特菌屬的七個種中,兩個種為病原種,即產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌(Listeria monocytogenes)和伊氏李斯特菌(Listeria ivanovii)。產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌是重要的食源性人獸共患病原菌,而伊氏李斯特菌則會感染反芻獸,給畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來損失。本文的研究目的是:(1)以iap基因為基礎(chǔ),用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)其融合蛋白;(2)建立PCR體系,用于高效、快速、可靠地檢測李斯特菌屬以及區(qū)分其中的兩個致病種-產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌和伊氏李斯特菌;(3)對揚(yáng)州地區(qū)市場食品中致病性李斯特菌的污染率進(jìn)行初步的調(diào)查研究。 1.產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌iap基因的克隆及在大腸桿菌中的表達(dá) 本研究對產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌iap基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,將其重組到原核表達(dá)載體pET 30a(+)和pGEX 6p-1中,重組質(zhì)粒分別命名為pET 30a(+)-iap和pGEX 6p-1-iap。然后將這兩種重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)和BL21。獲得的重組菌BL21(DE3)(pET 30a(+)-iap)和BL21(pGEX6p-1-iap)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)及表達(dá)條件的優(yōu)化后,SDS-PAGE結(jié)果表明,iap基因成功的獲得了表達(dá)。其表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)超聲波裂解,高速離心分離上清和沉淀,分別進(jìn)行SDS-PAGE分析,結(jié)果顯示BL21(DE3)(pET30a(+)-iap)和BL21(pGEX6p-1-iap)的表達(dá)產(chǎn)物p60蛋白為部分可溶性蛋白。過柱純化之后的產(chǎn)物濃度分別為2.6mg/ml和1.8mg/ml。得到帶有兩種不同標(biāo)簽的可溶性的iap基因產(chǎn)物p60重組蛋白,為進(jìn)一步研究p60蛋白提供了材料。 2.致病性李斯特菌PCR快速檢測方法的建立 致病性李斯特菌在環(huán)境中廣泛存在,且存在共生現(xiàn)象,并且兩種致病性李斯特菌的危害對象并不相同。建立快速而有效的方法鑒定致病性李斯特菌以及區(qū)分產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌和伊氏李斯特菌在科學(xué)研究與疾病控制方面都非常有必要。本研究利用李斯特菌屬特異性毒力因子iap、溶血性李斯特菌特異性毒力因子hly和產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌特異性毒力因子inlB,建立了基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的檢測體系,用于高效、快速、可靠地檢測李斯特菌以及區(qū)分其中的兩個致病種即產(chǎn)單核李斯特菌和伊氏李斯特菌。PCR體系可檢測到3.46pg伊氏李斯特菌DNA和3.93pg產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌DNA。對16小時LEB增菌培養(yǎng)的模擬污染生豬肉、水和牛奶的增菌培養(yǎng)液用PCR檢測,結(jié)果檢測限達(dá)10CFU/10克生豬肉、10CFU/10ml水或牛奶。 3.食品和環(huán)境中致病性李斯特菌污染率調(diào)查研究 為了解揚(yáng)州地區(qū)致病性李斯特菌即產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌和伊氏李斯特菌在各類食品及市場環(huán)境樣品中的污染情況。自2007年2月-2007年4月采集揚(yáng)州地區(qū)三個農(nóng)貿(mào)市場(A、B、C)的各類食物樣品630份,市場環(huán)境污水樣品190份,采用增菌培養(yǎng)、選擇性培養(yǎng)和PCR鑒定方法對上述820份樣品進(jìn)行致病性李斯特菌的分離鑒定。結(jié)果顯示,農(nóng)貿(mào)市場A、B、C的各類食物樣品和市場環(huán)境污水Lm的平均污染率為1.34%,其中污染率最高的是市場B的豬肉樣品,達(dá)3.75%,污染率最低的為市場A的污水和海產(chǎn)品以及市場B和C的蔬菜樣品,污染率均為0%。統(tǒng)計學(xué)結(jié)果顯示各市場生肉樣品Lm的平均污染率(2.92%)要顯著高于其它食品中的污染率。三個農(nóng)貿(mào)市場820份樣品中,市場B和市場C的海產(chǎn)品淡菜中各檢出1份伊氏李斯特菌陽性樣品,陽性率為0.24%,其中污染最嚴(yán)重的是市場B的海產(chǎn)品,污染率達(dá)1.43%,其余樣品污染率均為0%。此外,兩份伊氏李斯特菌陽性樣品均存在兩種致病性李斯特菌混合污染,其余樣品中未檢測到混合污染。從上述結(jié)果可以看出:(1)揚(yáng)州地區(qū)各類食物樣品以及市場環(huán)境污水存在不同程度的致病性李斯特菌污染;(2)新鮮豬肉比其它食品更適合Lm的生長或傳播;(3)伊氏李斯特菌在海產(chǎn)品中偶見污染,值得注意。以上結(jié)果為食品安全措施的制定提供了科學(xué)的依據(jù)。
【圖文】：

inlBInlB和InlA在基因上同被一個操縱子調(diào)控，并且在產(chǎn)單核程中也起著非常重要的作用[18]。此外，InlB的作用范圍較InlA緊密地錨定在細(xì)胞膜上，而是通過被稱為GW結(jié)構(gòu)域的部分和它和InlA同屬于內(nèi)化素家族，在其氮端也具有一個富含亮氨酸單核細(xì)胞李斯特菌進(jìn)入細(xì)胞的過程中起著關(guān)鍵的作用[20]。InlB子（HGF）的受體Met，HGF是一種酪氨酸激酶受體，它廣泛胎盤，它同時也是一種能夠引起腫瘤病變的原癌基因。值得一的天然配體肝細(xì)胞生長因子在結(jié)構(gòu)上并不一樣，事實證明，肝InlB與Met結(jié)合，因為InlB和肝細(xì)胞生長因子在Met上結(jié)合的位圖 1. InlA 所產(chǎn)生的內(nèi)化作用的示意圖Fig1. The pathway of InlA

3.1.3 iapiap(invasion associated protein)基因編碼 p60 蛋白，p60 是由李斯特菌產(chǎn)生的胞外蛋分子質(zhì)量為 60KDa，由 484 個氨基酸殘基組成的多肽鏈，它含有一個 Thr-Asn 的重復(fù)區(qū)域，具有水解酶和酰胺酶活性。通常 p60 蛋白于細(xì)胞表面產(chǎn)生，并大量分泌到生長中,在對某些缺失 iap 基因的李斯特菌變異株的研究中表明，它對于該菌的分裂是必不的，并與該菌的侵襲性有密切關(guān)系[24]。分析 p60 蛋白編碼基因的突變體顯示，對于 L吞噬細(xì)胞溶解作用以及對機(jī)體的感染過程，p60 蛋白是一個重要的因素。iap 基因的表受 PrfA 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的調(diào)節(jié)，對于 iap 基因的表達(dá)調(diào)節(jié)發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后的水平上。目前到的所有李斯特菌都含有 p60 蛋白或其同系物。但不同種的李斯特菌編碼的 p60 蛋白 和 C 端區(qū)域都具有高度的保守性，不同種 p60 的中間區(qū)域各具特異性，這些特異性可圖 2. InlB 所產(chǎn)生的內(nèi)化作用的示意圖Fig2. The pathway of InlB
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R378

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前5條

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本文編號：2579771