發(fā)布時間：2020-02-12 07:14

【摘要】：日本血吸蟲病(Schistosomiasis japonicum)是一種嚴(yán)重危害人類身體健康、影響經(jīng)濟(jì)和社會發(fā)展的人畜共患寄生蟲病。不同發(fā)育階段的血吸蟲蟲體在蛋白表達(dá)、生理生化特征等方面都存在一些差異。血吸蟲童蟲是血吸蟲在終宿主體內(nèi)發(fā)育的早期階段,一些童蟲差異表達(dá)蛋白可能對血吸蟲生長發(fā)育至關(guān)重要。本研究應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析、研究血吸蟲童蟲差異表達(dá)蛋白,克隆和表達(dá)了血吸蟲童蟲差異表達(dá)蛋白烯醇酶SjEnol基因,為研制抗感染的分子疫苗、診斷抗原、新治療藥物提供基礎(chǔ)。 本研究應(yīng)用雙向電泳技術(shù)對日本血吸蟲(中國大陸株)童蟲(16日齡)和成蟲(雌、雄蟲,40日齡)蟲體可溶性蛋白進(jìn)行了分離,應(yīng)用image—master軟件分析童蟲、雌蟲和雄蟲的雙向電泳圖譜,顯示兩個不同發(fā)育時期蟲體在可溶性蛋白組分上分別分離到2000±69、1100±75和1310±18個蛋白斑點,這些蛋白斑點大部分在Mr 10～80 KD、pI 3～8的電泳圖譜區(qū)域,其中童蟲蛋白電泳圖譜中呈現(xiàn)26±2個不同于成蟲的特異表達(dá)蛋白斑點。 從童蟲期差異表達(dá)的蛋白斑點中選取10個對比性最強(qiáng)的蛋白斑點進(jìn)行質(zhì)譜鑒定,結(jié)果成功地獲得了其中5個蛋白斑點的肽指紋圖譜檢測數(shù)據(jù),進(jìn)一步通過MASCOT、ProFound和Scope等軟件查詢數(shù)據(jù)庫對目標(biāo)蛋白進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明這些差異表達(dá)蛋白主要參與蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、能量代謝、轉(zhuǎn)錄、翻譯調(diào)控和作為細(xì)胞構(gòu)架蛋白等。 基于日本血吸蟲期別差異表達(dá)蛋白質(zhì)組的研究分析結(jié)果,選擇一個童蟲差異表達(dá)的蛋白分子進(jìn)行深入研究,通過質(zhì)譜(ESI)分析鑒定得到該蛋白質(zhì)的部分氨基酸序列,利用RACE、PCR技術(shù)克隆出該目的蛋白編碼基因,其ORF的核苷酸序列有1305bp,推測編碼434個氨基酸,同源分析表明該蛋白為日本血吸蟲烯醇酶(SjEnol)。構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET28 a(+)
【圖文】：

結(jié)果表明蛋白質(zhì)為putativearyl一alcoholdehydrogenaseAAD6、Glyeeraldehyde一3一PhosPhatedehydrogenase、Enolase和AnPahasePromotingeomPlexsubunitCDC26。詳見附圖1、2。分析顯示T16和T18可能是同一蛋白，它們和Glyeeraldehyde一3一phosphatedehydrogenase有很高的的匹配，至于為什么在同一膠圖上會出現(xiàn)同一蛋白分布在D2膠的兩個不同位置上的情況，這可能是在樣品提取過程中長的肚段被部分降解或修飾加工不同;也有可能這兩種蛋白斑點并不代表同一蛋白分子，可能是同源性很高的兩種蛋白，但是目前由于質(zhì)譜檢測技術(shù)的局限性，不能鑒定給出相關(guān)數(shù)據(jù)。第20頁

雌蟲童蟲雄蟲圖2通過雙向電泳分離的一個童蟲期差異表達(dá)蛋白斑點的局部放大圖白斑點的ESI檢測數(shù)據(jù):蛋白斑點經(jīng)ESI質(zhì)譜鑒定分析，獲得一段可靠的氨基酸序列。R·TFRSERLAKYNQLLLGR.13’ARCE考ESI的反應(yīng)引物:質(zhì)譜的檢測數(shù)據(jù)結(jié)合血吸蟲密碼子的編碼規(guī)律，，按照簡并密碼子翻譯的并密碼子，依據(jù)統(tǒng)計學(xué)原理，共設(shè)計引物15條，分別進(jìn)行CPR操作。實驗結(jié)果可行，引物序列為:5’一TTGTGcATCGT從GCTCTTGGC從一3’。3’ARCE的反應(yīng)結(jié)果的電泳圖:
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2005
【分類號】：R383.24

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2578743