【摘要】：目的:利用畢赤酵母表達體系表達重組人腺激肽釋放酶2,獲得了有活性的人腺激肽釋放酶2。建立測定人精漿中腺激肽釋放酶2活性方法,研究測定不同類型不育癥患者精漿中腺激肽釋放酶活性水平。為臨床相關(guān)疾病的監(jiān)測,診斷和治療提供了關(guān)鍵材料和方法。 方法:通過RT-PCR的方法從前列腺組織獲得編碼成hK2的cDNA。構(gòu)建表達載體pPICZαC-mhK2及具有3個表達盒子的pPICZαC-3mhK2。采用電轉(zhuǎn)法,用重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染畢赤酵母X33細胞,Zeocin篩選,甲醇誘導(dǎo)X33細胞表達rhK2,篩選高表達rhK2的細胞株。離子交換層析純化rhK2蛋白。SDS-PAGE和Western Blot鑒定重組蛋白,使用特異性底物(H-D-Pro-Phe-Arg-pNA)檢測重組hK2的酶活性。探討了溫度、pH值等對測定hK2活性的影響,設(shè)計建立測定人精漿中hK2活性的方法。 結(jié)果:獲得了人hK2全長序列,構(gòu)建了克隆及表達載體pPICZα-mhK2和pPICZαC-3mhK2。獲得了高表達rhK2的酵母X33細胞株。離子交換層析得到純化的rhK2,其酶活性接近正常精漿中hK2的酶活性。建立起測定人精漿中hK2活性的方法。發(fā)現(xiàn)多種不育癥精漿中hK2的酶活性下降。 結(jié)論:畢赤酵母能夠成功表達人腺激肽釋放酶2,本實驗獲得的rhK2的酶活性接近正常精漿中hK2酶活性,我們建立起來的測定人精漿中hK2活性的方法為男性不育癥的診斷提供有價值的參數(shù),部分不育癥患者精漿中的hK2活性顯著下降。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號】：R341

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