【摘要】：目的:利用畢赤酵母表達(dá)體系表達(dá)重組人腺激肽釋放酶2,獲得了有活性的人腺激肽釋放酶2。建立測(cè)定人精漿中腺激肽釋放酶2活性方法,研究測(cè)定不同類型不育癥患者精漿中腺激肽釋放酶活性水平。為臨床相關(guān)疾病的監(jiān)測(cè),診斷和治療提供了關(guān)鍵材料和方法。 方法:通過(guò)RT-PCR的方法從前列腺組織獲得編碼成hK2的cDNA。構(gòu)建表達(dá)載體pPICZαC-mhK2及具有3個(gè)表達(dá)盒子的pPICZαC-3mhK2。采用電轉(zhuǎn)法,用重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染畢赤酵母X33細(xì)胞,Zeocin篩選,甲醇誘導(dǎo)X33細(xì)胞表達(dá)rhK2,篩選高表達(dá)rhK2的細(xì)胞株。離子交換層析純化rhK2蛋白。SDS-PAGE和Western Blot鑒定重組蛋白,使用特異性底物(H-D-Pro-Phe-Arg-pNA)檢測(cè)重組hK2的酶活性。探討了溫度、pH值等對(duì)測(cè)定hK2活性的影響,設(shè)計(jì)建立測(cè)定人精漿中hK2活性的方法。 結(jié)果:獲得了人hK2全長(zhǎng)序列,構(gòu)建了克隆及表達(dá)載體pPICZα-mhK2和pPICZαC-3mhK2。獲得了高表達(dá)rhK2的酵母X33細(xì)胞株。離子交換層析得到純化的rhK2,其酶活性接近正常精漿中hK2的酶活性。建立起測(cè)定人精漿中hK2活性的方法。發(fā)現(xiàn)多種不育癥精漿中hK2的酶活性下降。 結(jié)論:畢赤酵母能夠成功表達(dá)人腺激肽釋放酶2,本實(shí)驗(yàn)獲得的rhK2的酶活性接近正常精漿中hK2酶活性,我們建立起來(lái)的測(cè)定人精漿中hK2活性的方法為男性不育癥的診斷提供有價(jià)值的參數(shù),部分不育癥患者精漿中的hK2活性顯著下降。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號(hào)】：R341

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本文編號(hào)：2578641