【摘要】： 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是食品中常見的污染菌且能產(chǎn)生腸毒素，被認(rèn)為是引起細(xì)菌性食物中毒最普遍的原因之一。另外，它還涉及許多感染性疾病，引起感染后可影響到宿主的任何器官，有時甚至是致命的。腸毒素種類繁多，新的血清型，如SEG、SHE、SEI、SEJ、SEK、SEL、SEM、SEN和SEO目前還沒有商業(yè)檢測系統(tǒng)可利用。金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶與腸毒素在食物儲存與加工的各種條件下都能保持相似的穩(wěn)定性，并且耐熱核酸酶與腸毒素有很高的符合率，因此可作為金黃色葡萄球菌引起食物中毒的指示劑。另外，金黃色葡萄球菌的許多毒力因子是由雙元組份系統(tǒng)來控制的，但精確的調(diào)控機(jī)制目前知道的仍不多。 本文以金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶相關(guān)基因?yàn)橹饕芯繉ο螅容^了金黃色葡萄球菌幾個株系的生化特性、外蛋白分泌情況及腸毒素的基因類型；建立了檢測金黃色葡萄球菌，特別是產(chǎn)腸毒素性金黃色葡萄球菌的雙重PCR方法；證實(shí)了金黃色葡萄球菌中兩個不同基因源核酸酶的共表達(dá)現(xiàn)象；探討了金黃色葡萄球菌兩個主要的調(diào)控位點(diǎn)agr和sae對耐熱核酸酶表達(dá)的影響。主要研究內(nèi)容如下： 1、檢測了金黃色葡萄球菌幾個株系的生化特性、胞外蛋白的分泌情況和腸毒素的基因類型，以證實(shí)金黃色葡萄球菌的基本特性。結(jié)果表明：所有菌株都可發(fā)酵葡萄糖、蔗糖和甘露糖，菌株S2、26111、S1’、S2’、S3’可分解精氨酸，菌株S6、S2、S1’、S3’尿酶試驗(yàn)顯陽性，菌株S2’的H_2S試驗(yàn)呈陽性，菌株26111可分解肌醇和密二糖，菌株26111和S2’可分解山梨醇、苦杏仁苷和阿拉伯糖；菌株S6、S2、S1’和S3’可產(chǎn)生血漿凝固酶、蛋白A、α-溶血素、β-溶血素、耐熱核酸酶、腸毒素，及表皮剝脫毒素等，這是它們導(dǎo)致食物中毒或其它疾病的可能原因；根據(jù)腸毒素基因的五對特異性引物進(jìn)行了多重PCR擴(kuò)增，腸毒素的多重PCR檢測驗(yàn)證了胞外分泌蛋白的SDS-PAGE檢測，它們具有一致性。 2、比較了金黃色葡萄球菌DNA的四種提取方法，并對方法4進(jìn)行了改進(jìn)，用70％的乙醇處理菌細(xì)胞使得提取的DNA質(zhì)量更高；利用新的候選基因nuc2(首次應(yīng)用)和16S rRNA的保守序列設(shè)計(jì)了兩對特異性引物，耐熱核酸酶的分析結(jié)果與擴(kuò)增結(jié)果100％符合；靈敏度分析表明檢測限是9.35pg／μl金黃色葡萄球菌DNA，對于人工污染牛奶的檢測，用PCR直接進(jìn)行擴(kuò)增，樣品的檢測限可以達(dá)到10~4～10~5CFU；基于增菌培養(yǎng)，其檢測限可達(dá)到1CFU；在本研究中應(yīng)用了均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化反應(yīng)條件，雙重PCR結(jié)果與腸毒素基因的多重PCR檢測結(jié)果也是100％相吻合，沒有出現(xiàn)假陰性或假陽性，建立了一種快速、簡易、高效和準(zhǔn)確的方法，可以檢測所有的金黃色葡萄球菌，同時也能檢測出產(chǎn)腸毒素的菌株。 3、檢測了不同培養(yǎng)條件對耐熱核酸酶活性、金黃色葡萄球菌生物量的影響以及它們之間的相互關(guān)系，以探究金黃色葡萄球菌生長的不同微生境對核酸酶分泌的影響。結(jié)果表明，pH7.0時菌體生長最好，pH9.0-9.6時核酸酶的活性最強(qiáng)；當(dāng)菌數(shù)達(dá)到3.2×10~3 CFU／ml時，已經(jīng)可以檢測到核酸酶活性，對數(shù)生長期之后核酸酶活性基本上保持不變：不同濃度NaCl影響下，耐熱核酸酶的活性曲線與金黃色葡萄球菌菌體濃度曲線變化趨勢較為一致，可能NaCl對耐熱核酸酶產(chǎn)生影響較小或無影響；100℃處理55 min時核酸酶活性保持不變，95min時核酸酶活性有所下降，到135min還有很強(qiáng)的活性，證實(shí)了耐熱核酸酶是一種穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。 4、目前認(rèn)為金黃色葡萄球菌的熱穩(wěn)定性核酸酶只源于一個基因編碼，即葡萄球菌核酸酶(Staphylococcal nuclease，SNase)的編碼基因(這里命名為nuc1)，但全基因組中發(fā)現(xiàn)了另一個新的候選基因nuc(這里命名為nuc2)，預(yù)測其產(chǎn)物是耐熱核酸酶(Thermonuclease，TNase)。為了證實(shí)兩個基因功能的相關(guān)性，選用兩個原核表達(dá)載體pET-17b和pET-28a，構(gòu)建了四個重組表達(dá)載體pET17-nuc2、pET17-nucl、pET28-nuc2和pET28-nuc1分別對兩個不同的核酸酶基因進(jìn)行了克隆和表達(dá)，結(jié)果表明四個重組表達(dá)蛋白都具有分泌核酸酶的活性；進(jìn)一步應(yīng)用生物學(xué)軟件對SNase和TNase的氨基酸序列進(jìn)行了比對，這兩個不同基因源的酶有較高的相似性，通過比對還發(fā)現(xiàn)人們多年來一直研究的SNase A蛋白是來自nuc1基因編碼的一部分。 5、為了進(jìn)一步探討nuc2基因能否在金黃色葡萄球菌體內(nèi)表達(dá)核酸酶，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pBT_2Δnuc1并電轉(zhuǎn)入菌株RN4220中，經(jīng)過七輪培養(yǎng)和篩選，重組幾率為2％(7/345)。篩選出的nuc1突變株用PCR方法和RT-PCR進(jìn)行了驗(yàn)證，從而獲得nuc1基因的缺失突變株RNΔnuc1。生化特性比較結(jié)果表明，親本株和突變株均具有分解核酸的活性，只是突變株的活性明顯降低，經(jīng)過121℃，30 min高壓滅菌之后，依舊有酶活，表明兩個不同的基因均能表達(dá)耐熱性核酸酶；進(jìn)一步檢測親本株和突變株的胞外表達(dá)蛋白，二者在18.4 kDa和14.4 kDa附近有區(qū)別，突變株在大約16.8 kDa和12.0 kDa附近的兩條帶消失了，而在大約9 kDa附近多了一條帶�；パa(bǔ)驗(yàn)證時，構(gòu)建了互補(bǔ)表達(dá)質(zhì)粒pBT_2-NUC1C，互補(bǔ)表達(dá)質(zhì)粒可大大恢復(fù)核酸酶的活性。 6、構(gòu)建了同源重組穿梭質(zhì)粒pBT_2Δsae，電轉(zhuǎn)化到金黃色葡萄球菌菌株RN4220中，在40℃經(jīng)過七輪培養(yǎng)后，經(jīng)過抗性培養(yǎng)基篩選、PCR和RT-PCR驗(yàn)證，獲得了金黃色葡萄球菌sae基因缺失突變株RNΔsae。比較RNΔsae株及其親本菌株RN4220、agr位點(diǎn)突變株RN6911和SH1000 1046及其親本菌株SH1000 682的耐熱核酸酶的分泌情況，結(jié)果agr位點(diǎn)的缺失對耐熱核酸酶活性影響不明顯；而sae位點(diǎn)的缺失對耐熱核酸酶分泌的影響較大，親本株RN4220和突變株RNΔsae的胞外分泌蛋白存在著顯著區(qū)別，有三條帶(α-溶血素、β-溶血素、蛋白A)在突變株RNΔsae中明顯減弱。
【圖文】：

圖14金黃色有萄球菌毒力因子的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(F門mcheu飛ALetal.，F(xiàn)EMsL.InuuologyandMed如.Mk功b如】0盯40(2側(cè)媽)1·，)價9.1·IR雌腳la如nofv五ruleucedetert川nants恤s.au柑usbyglobal作gUlato叮.OCi13.1雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)(TCRss，two一co哪onentre羅lato叮systems)TCRS在原核細(xì)菌中總是跟隨著一個膜傳感器和一個反應(yīng)調(diào)控因子，膜傳感器分子的C一末端和反應(yīng)調(diào)控因子的N一末端的結(jié)構(gòu)域總是高度保守，，已經(jīng)在金黃色葡萄球菌的全基因組中識別出了16個這樣的TcRss(cheungatal.，2002)，其中6個已經(jīng)有一些研究，它們分別是A歹cA、saeRs(Giraudoetai.，1999)、LytRs(毗olska”etal.，2(X)2)、AilRS(Foun五eretai.，2001)、SrrAB(、乞n萬oodetai.，2001)和YyeFG(Dubrac。tai.，20()4.)。目前了解最清楚的雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)是agrAC，但是其他涉及到毒力因子調(diào)節(jié)的雙組分系統(tǒng)還沒有被描述的很清楚(saeRS，sr剮以。rlR況加幼‘)。這些調(diào)節(jié)系統(tǒng)對周圍的信號很敏感(例如agr編碼的自身誘導(dǎo)膚)，它是由兩個蛋白組成:組氨酸激酶和反應(yīng)調(diào)節(jié)子感受器。感受器或者直接與細(xì)胞外特殊的配基結(jié)合，或者和受體結(jié)合(B~tetal.，1998)。當(dāng)細(xì)胞外的配基與受體結(jié)合就產(chǎn)生自磷

2.2.4腸毒素基因的驗(yàn)證利用五對引物對金黃色葡萄球菌腸毒素的多重PCR擴(kuò)增是特異的，PCR產(chǎn)物的大小與理論大小相符合，如圖2一4所示，在六株菌中只有四個泳道出現(xiàn)帶型，泳道1擴(kuò)增子大小在732bP，泳道2擴(kuò)增子大小在582bP左右，泳道3和泳道4擴(kuò)增子大小在732bP左右，說明在所有的六株菌株中，有四株是腸毒素產(chǎn)生株。 M123466710O0bl扭OObP‘OObP400bP732bP582bP圖2一4:6株金黃色葡萄球菌的腸毒素多重PCR擴(kuò)增結(jié)果1、金黃色菊萄球菌S6;2、金黃色葡萄球菌S2;3、金黃色葡萄球菌26111;4、5、6分別為金黃色葡萄球菌分離株三株:7、陰性對照;M為200bp的ladderoFig·2礴 Agarosegeleleetro仲 oretogramofPCRP找心ucts加 mente功 toxingenesLaneM，200· bPDNAladderPlus;lanel，5.au咫 us56;IaneZ，5.au理 us52;lane3
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R378

【引證文獻(xiàn)】

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本文編號：2578769