【摘要】：DNA 疫苗又稱核酸疫苗,作為一種新型疫苗,DNA疫苗與傳統(tǒng)疫苗相比有著明顯的優(yōu)勢,如易于生產(chǎn),穩(wěn)定性強(qiáng),成本低廉等,并可同時(shí)誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫,但DNA疫苗的免疫效果在不同動(dòng)物個(gè)體中差異較大,有些疫苗在小個(gè)體的動(dòng)物中免疫和保護(hù)效果較好,而在大個(gè)體動(dòng)物中效果較差,尤其是在大型動(dòng)物和人類中,影響了它的實(shí)際應(yīng)用。如何增強(qiáng)DNA疫苗的免疫反應(yīng)成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。 我們以HBV DNA疫苗作為模型抗原,選擇結(jié)核分支桿菌的熱休克蛋白65、金黃色葡萄球菌腸毒素A和人胸腺素α原基因作為HBV DNA疫苗的佐劑,進(jìn)行DNA疫苗免疫佐劑的研究。 本研究克隆了HBV的preS2S基因、結(jié)核分支桿菌的熱休克蛋白65、金黃色葡萄球菌腸毒素A和人胸腺素α原基因,構(gòu)建了三種單獨(dú)表達(dá)的佐劑質(zhì)粒:pHSP65、pmSEA、pThyα;三種融合表達(dá)的佐劑-抗原質(zhì)粒:pHSP65/HBVs2s、pmSEA/HBVs2s、pThyα/HBVs2s;以及單獨(dú)的模型抗原質(zhì)粒pHBVs2s。體外瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293細(xì)胞或P815細(xì)胞,除外pmSEA/HBVs2s,Western Blot均檢測到目的蛋白的表達(dá),ELISA實(shí)驗(yàn)證實(shí)了轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)的HBsAg與相應(yīng)的抗HBsAg抗體能產(chǎn)生良好的免疫反應(yīng),說明表達(dá)的重組抗原具有抗原性。 DNA疫苗與其佐劑免疫小鼠。ELISA結(jié)果顯示三種佐劑均可增強(qiáng)pHBVs2s免疫小鼠抗HBs的產(chǎn)生,與單獨(dú)pHBVs2s免疫組相比,提高了抗HBs抗體滴度。激發(fā)抗HBs抗體滴度的高低順序依次是pHBVs2s+pThy α、pHBVs2s+pmSEA、pHBVs2s+pHSP65、pHBVs2s。ELISPOT檢測分泌IFN-γ的脾淋巴細(xì)胞數(shù)量高低順序依次是pHBVs2s+pmSEA、pHBVs2s+pThyα、pHBVs2s+pHSP65、pHBVs2s。HBsAg特異性CTLs的殺傷活性高低順序分泌IFN-γ的脾淋巴細(xì)胞數(shù)量高低相一致。兩種融合基因組小鼠也激發(fā)了抗HBs,其抗HBs抗體滴度的高低順序依次是pThyα/HBVs2s和pHSP65/HBVs2s,pmSEA/HBVs2s未能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗HBs抗體。HBsAg IgG亞類的分析發(fā)現(xiàn):pThyα、pmSEA和pHSP65明顯提高IgG2a,促進(jìn)Th0向Th1分化。
【圖文】：

2.表達(dá)載體的酶切鑒定。A)重組質(zhì)粒pHBvsZs酶切鑒定第1泳道為L一2000Mkar，er第2泳道為pHBvZss重組質(zhì)粒助nI和APal雙酶切。B)重組粒pHsP65酶切鑒定l為DL一2000Marker，2為pHsP65質(zhì)粒APa了酶切后(約642bp)，3為pHSp65質(zhì)粒酶切前。C)重組質(zhì)粒pmSEA酶切鑒l為oL一2000arke，r2為pmSEA經(jīng)EcoR工和BamH工雙酶切。3為未酶切的pmsEA。D)胸素a原重組質(zhì)粒(pThy)a的鑒定l為pTha質(zhì)粒BmaHI和EcoRI雙酶切，切約33obp的片段(Thya基因)。2為oL一2000Marker。組質(zhì)粒在293細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)驗(yàn)證上述表達(dá)載體在動(dòng)物細(xì)胞系中可有效表達(dá)重組抗原及佐劑蛋白，分別表達(dá)載體P(HBVsZs、pHSP65、pmSEA、pThya)及空載體(peDNA3一Flag)93細(xì)胞，48小時(shí)后收獲細(xì)胞，使用細(xì)胞裂解液將細(xì)胞裂解，離心取上清，DS一APGE蛋白電泳，以半干電泳轉(zhuǎn)移儀將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，封閉Flga單克隆抗體進(jìn)行Westemblot檢測，ECL顯色系統(tǒng)(PekrniElmer)進(jìn)

核酸疫苗的基因佐劑研究結(jié)果行顯色。結(jié)果表明，HBVPrSeZS、HSP65、mSEA及胸腺素。原在293細(xì)胞中均獲得了有效表達(dá)(圖3)。與現(xiàn)有報(bào)道一致，pHBVsZs重組質(zhì)粒表達(dá)的HBsAg蛋白有單糖和雙糖兩種糖基化形式(GP33和GGP36)(圖.3a)【73]。其它各重組質(zhì)粒表達(dá)的蛋白帶HSP65為65Kd(圖.3b);SEA為23Kd(圖.3c);胸腺素。原為13Kd的蛋白帶(圖.3d)。pHBVsZs質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞裂解液經(jīng)乙型肝炎抗原HBsAg的ELIsA法分析，，結(jié)果顯示在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的HBsAg與相應(yīng)的抗HBsAg抗體能產(chǎn)生良好的免疫反應(yīng)(圖.4)，說明表達(dá)的重組抗原具有抗原性。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2005
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2578515