【摘要】：DNA 疫苗又稱核酸疫苗,作為一種新型疫苗,DNA疫苗與傳統(tǒng)疫苗相比有著明顯的優(yōu)勢,如易于生產(chǎn),穩(wěn)定性強,成本低廉等,并可同時誘導(dǎo)體液免疫和細胞免疫,但DNA疫苗的免疫效果在不同動物個體中差異較大,有些疫苗在小個體的動物中免疫和保護效果較好,而在大個體動物中效果較差,尤其是在大型動物和人類中,影響了它的實際應(yīng)用。如何增強DNA疫苗的免疫反應(yīng)成為當(dāng)前研究的熱點和難點。 我們以HBV DNA疫苗作為模型抗原,選擇結(jié)核分支桿菌的熱休克蛋白65、金黃色葡萄球菌腸毒素A和人胸腺素α原基因作為HBV DNA疫苗的佐劑,進行DNA疫苗免疫佐劑的研究。 本研究克隆了HBV的preS2S基因、結(jié)核分支桿菌的熱休克蛋白65、金黃色葡萄球菌腸毒素A和人胸腺素α原基因,構(gòu)建了三種單獨表達的佐劑質(zhì)粒:pHSP65、pmSEA、pThyα;三種融合表達的佐劑-抗原質(zhì)粒:pHSP65/HBVs2s、pmSEA/HBVs2s、pThyα/HBVs2s;以及單獨的模型抗原質(zhì)粒pHBVs2s。體外瞬時轉(zhuǎn)染293細胞或P815細胞,除外pmSEA/HBVs2s,Western Blot均檢測到目的蛋白的表達,ELISA實驗證實了轉(zhuǎn)染細胞表達的HBsAg與相應(yīng)的抗HBsAg抗體能產(chǎn)生良好的免疫反應(yīng),說明表達的重組抗原具有抗原性。 DNA疫苗與其佐劑免疫小鼠。ELISA結(jié)果顯示三種佐劑均可增強pHBVs2s免疫小鼠抗HBs的產(chǎn)生,與單獨pHBVs2s免疫組相比,提高了抗HBs抗體滴度。激發(fā)抗HBs抗體滴度的高低順序依次是pHBVs2s+pThy α、pHBVs2s+pmSEA、pHBVs2s+pHSP65、pHBVs2s。ELISPOT檢測分泌IFN-γ的脾淋巴細胞數(shù)量高低順序依次是pHBVs2s+pmSEA、pHBVs2s+pThyα、pHBVs2s+pHSP65、pHBVs2s。HBsAg特異性CTLs的殺傷活性高低順序分泌IFN-γ的脾淋巴細胞數(shù)量高低相一致。兩種融合基因組小鼠也激發(fā)了抗HBs,其抗HBs抗體滴度的高低順序依次是pThyα/HBVs2s和pHSP65/HBVs2s,pmSEA/HBVs2s未能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗HBs抗體。HBsAg IgG亞類的分析發(fā)現(xiàn):pThyα、pmSEA和pHSP65明顯提高IgG2a,促進Th0向Th1分化。
【圖文】：

2.表達載體的酶切鑒定。A)重組質(zhì)粒pHBvsZs酶切鑒定第1泳道為L一2000Mkar，er第2泳道為pHBvZss重組質(zhì)粒助nI和APal雙酶切。B)重組粒pHsP65酶切鑒定l為DL一2000Marker，2為pHsP65質(zhì)粒APa了酶切后(約642bp)，3為pHSp65質(zhì)粒酶切前。C)重組質(zhì)粒pmSEA酶切鑒l為oL一2000arke，r2為pmSEA經(jīng)EcoR工和BamH工雙酶切。3為未酶切的pmsEA。D)胸素a原重組質(zhì)粒(pThy)a的鑒定l為pTha質(zhì)粒BmaHI和EcoRI雙酶切，切約33obp的片段(Thya基因)。2為oL一2000Marker。組質(zhì)粒在293細胞中瞬時表達驗證上述表達載體在動物細胞系中可有效表達重組抗原及佐劑蛋白，分別表達載體P(HBVsZs、pHSP65、pmSEA、pThya)及空載體(peDNA3一Flag)93細胞，48小時后收獲細胞，使用細胞裂解液將細胞裂解，離心取上清，DS一APGE蛋白電泳，以半干電泳轉(zhuǎn)移儀將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，封閉Flga單克隆抗體進行Westemblot檢測，ECL顯色系統(tǒng)(PekrniElmer)進

核酸疫苗的基因佐劑研究結(jié)果行顯色。結(jié)果表明，HBVPrSeZS、HSP65、mSEA及胸腺素。原在293細胞中均獲得了有效表達(圖3)。與現(xiàn)有報道一致，pHBVsZs重組質(zhì)粒表達的HBsAg蛋白有單糖和雙糖兩種糖基化形式(GP33和GGP36)(圖.3a)【73]。其它各重組質(zhì)粒表達的蛋白帶HSP65為65Kd(圖.3b);SEA為23Kd(圖.3c);胸腺素。原為13Kd的蛋白帶(圖.3d)。pHBVsZs質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的293細胞裂解液經(jīng)乙型肝炎抗原HBsAg的ELIsA法分析，，結(jié)果顯示在細胞內(nèi)表達的HBsAg與相應(yīng)的抗HBsAg抗體能產(chǎn)生良好的免疫反應(yīng)(圖.4)，說明表達的重組抗原具有抗原性。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2005
【分類號】：R392

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本文編號：2578515