【摘要】：由于結(jié)核分枝桿菌 (Mycobacterium tuberculosis) 的感染而引起的結(jié)核病目前是傳染病首位殺手。主要原因之一是耐多藥的結(jié)核分枝桿菌菌株的日益增加,而現(xiàn)有的抗結(jié)核藥物不能有效地治愈結(jié)核病,導(dǎo)致結(jié)核病患者的死亡率顯著增加。因此,迫切需要研發(fā)有效的抗結(jié)核新藥。 藥物研發(fā)的關(guān)鍵是確定藥物作用的靶標(biāo)。結(jié)核分枝桿菌的細胞壁在其生存和增殖過程中起著重要的作用,并且細胞壁的組成成分和結(jié)構(gòu)比較獨特。被分枝菌酸酯化的聚阿拉伯糖與聚半乳糖通過銜接雙糖 (L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺) 共價連接到肽聚糖分子上,以形成分枝桿菌細胞壁的核心結(jié)構(gòu)。鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶的功能是將 dTDP-鼠李糖供體的鼠李糖基轉(zhuǎn)移到 D-N-乙酰葡糖胺分子上而形成銜接雙糖,并且鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶是分枝桿菌生長所必需的酶,因此,鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶可作為研發(fā)抗結(jié)核新藥的理想靶標(biāo)。 為了建立體外篩選抗結(jié)核藥物的分子模型,我們首先要克隆編碼結(jié)核分枝桿菌鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶的 wbbL 基因,然后利用大腸桿菌高效表達 WbbL 蛋白質(zhì),為進一步研究鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶的酶促反應(yīng)動力學(xué)及建立篩選抗結(jié)核藥物的酶反應(yīng)體系提供物質(zhì)保 2 障。 結(jié)核分枝桿菌 H37Rv 菌株的基因組測序工作已完成。因此 , H37Rv 基因組數(shù)據(jù)庫為快速克隆目的基因提供了保障。編碼結(jié)核 分枝桿菌鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶的 wbbL 基因為基因組中的第 3265 個開放閱讀框 Rv3265。 本論文的目的是: (1) 利用 PCR 方法從結(jié)核分枝桿菌 H37Rv 菌株的基因組 DNA 中擴增出 Tb wbbL 基因;(2) 將 Tb wbbL 基因克隆到 pMD18-T 克隆載體中,經(jīng) DNA 序列測定證實為正確的基因; (3) 將 Tb wbbL 基因亞克隆到 pET16b 表達載體中并通過改變 不同的誘導(dǎo)條件在大腸桿菌 BL21(DE3) 中表達 Tb WbbL 蛋白 質(zhì);(4) 建立在 BL21(DE3) 大腸桿菌中共表達 Tb WbbL 蛋白質(zhì) 與分子伴侶的體系,優(yōu)化表達條件以高效表達出可溶性 Tb WbbL 蛋白質(zhì);(5) 用 Western blot 方法鑒定所表達的 Tb WbbL 蛋白 質(zhì)為 Tb wbbL 基因產(chǎn)物。 本論文所獲得的結(jié)果如下: 1.利用 PCR 方法擴增出正確的目的 wbbL 基因 從結(jié)核分枝桿菌 H37Rv 菌株基因組數(shù)據(jù)庫 (http://genolist. pasteur.fr/TubercuList/) 中獲得 Tb wbbL 基因的核苷酸序列 (906 bp)。根據(jù)其核苷酸序列設(shè)計一對 PCR 引物,并在上游引物和下 游引物的 5’端分別引入了 NdeⅠ和 BamHⅠ限制性內(nèi)切酶位 點。以便將 wbbL 基因克隆到 pET16b 表達載體的 NdeⅠ和 BamHⅠ位點。用具高保真性的 LA Taq DNA 聚合酶,以 H37Rv 菌株基因組 DNA 為模板成功擴增了 wbbL 基因。 2.pMD18-Tb wbbL 的構(gòu)建及核苷酸序列測定 將純化的 PCR 產(chǎn)物與 pMD18-T 載體進行連接,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn) 化到大腸桿菌 NovaBlue 菌株的感受態(tài)細胞中。用限制性內(nèi)切酶酶切 及 PCR 方法鑒定出陽性重組質(zhì)粒 pMD18-Tb wbbL。對 pMD18-Tb wbbL 中的 Tb wbbL 基因進行 DNA 序列測定,對 DNA 測序結(jié) 果進行 BLAST 分析,結(jié)果表明所克隆的 Tb wbbL 基因與結(jié)核分枝桿 3 菌 H37Rv 菌株基因組數(shù)據(jù)庫中 wbbL 基因的核苷酸序列完全一 致,表明利用 PCR 技術(shù)擴增出的 Tb wbbL 基因不存在任何堿基 突變。 3.表達載體 pET16b-Tb wbbL 的構(gòu)建 用 NdeⅠ和 BamHⅠ雙酶切 pMD18-Tb wbbL 陽性重組質(zhì) 粒,回收與純化 Tb wbbL 基因后,將 Tb wbbL 基因連接到表達 載體 pET16b 的 NdeⅠ和 BamHⅠ位點,并用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 NovaBlue 感受態(tài)細胞。用 NdeⅠ和 BamHⅠ雙酶切方法和 PCR 方法鑒定重組表達載體 pET16b-Tb wbbL,表達載體中的 Tb wbbL 基因產(chǎn)物的 N 端與 pET16b 表達載體上的 10 個連續(xù)組氨酸 標(biāo)記形成融合蛋白,便于目的蛋白的檢測和純化。 4.Tb WbbL 蛋白質(zhì)在大腸桿菌 BL21(DE3) 中的表達 將 pET16b 質(zhì)粒及 pET16b-Tb wbbL 質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到 BL21(DE3) 感受態(tài)細胞中。用不同條件 (IPTG 濃度、誘導(dǎo)溫度及誘導(dǎo)時間等) 誘 導(dǎo) Tb wbbL 的表達。用超聲方法破碎誘導(dǎo)的 BL21(DE3),對上清和沉 淀組分進行 SDS-PAGE 電泳分析。結(jié)果表明 Tb WbbL 蛋白質(zhì) 在 BL21(DE3) 中得以表達,但以包涵體形式存在。 5.Tb WbbL 蛋白質(zhì)與分子伴侶共表達體系的建立及 Tb WbbL 的優(yōu)化表達 將攜帶分子伴侶的 pKJE7 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到 BL21(DE3) 感受態(tài)細 胞中,之后再將 pET16b-Tb wbbL 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到攜帶 pKJE7 質(zhì)粒的 BL21(DE3) 感受態(tài)細胞中 (兩步法)。用不同條件 (L-阿拉伯糖及 IPTG 濃度、誘導(dǎo)時間及誘導(dǎo)溫度等) 誘導(dǎo)分子伴侶和 Tb WbbL 蛋 白質(zhì)基因的共表達。用超聲方法破碎攜帶 pKJE7 和 pET16b-Tb wbbL 的 BL21(DE3),用 SDS-PAGE 電泳分析上清及沉淀組分中 的表達產(chǎn)物,結(jié)果表明 Tb WbbL 蛋白質(zhì)主要以可溶性形式存在。 6.用 Western blot 方法對 Tb WbbL 蛋白質(zhì)的鑒定 將 SDS-PAGE 凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上,用抗 多聚組氨酸的單克隆抗體及偶聯(lián)堿性磷酸酶的馬抗小鼠 IgG 二 抗進行檢測,結(jié)果表明,所表達的 Tb WbbL 蛋白質(zhì)為 Tb wbbL
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2005
【分類號】：R346

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本文編號：2577086