【摘要】： 細(xì)胞凋亡(apoptosis)是細(xì)胞受到生理或病理刺激后發(fā)生的自發(fā)性死亡過程。AIF(Apoptosis Inducing Factor,凋亡誘導(dǎo)因子)是1996年發(fā)現(xiàn)的一種凋亡效應(yīng)分子。正常情況下,AIF蛋白定位于細(xì)胞線粒體膜間隙,當(dāng)有凋亡信號刺激時,AIF分子從線粒體釋放到細(xì)胞漿,再通過其核定位信號轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核中,直接引起染色體凝集和DNA的大片段(~50kb)斷裂,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。 AIF的促凋亡活性不受Bcl-2過表達(dá)的影響,也不依賴于caspases的活性,在低等真核細(xì)胞凋亡、以及哺乳類胚胎發(fā)育過程中AIF也具有不可或缺的作用。與caspases等其他凋亡效應(yīng)分子相比,AIF可直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生而不受胞漿中其他凋亡抑制因子的抑制, AIF的這一優(yōu)勢對于它誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,具有特殊意義。 Susin等研究發(fā)現(xiàn),人AIF前體蛋白為67kD,包括以下幾個結(jié)構(gòu)域:從氨基端起,(1)氨基端100 aa長度的線粒體定位信號(MLS);(2)27aa的Spacer序列;(3)核定位信號(NLS);(4)羧基端485aa的氧化還原酶功能域(129-613位氨基酸)。AIF前體分子在線粒體被切割后,形成成熟的AIF分子,它由三部分構(gòu)成:一個FAD結(jié)合結(jié)構(gòu)域(122-262aa和400-477aa),一個NADH結(jié)合結(jié)構(gòu)域(263-399aa)和一個C末端結(jié)構(gòu)域(478-610aa)。 本室于翠娟博士成功克隆了成熟型AIF分子(AIFΔ1-120),并且證實(shí)了其促凋亡活性。在此基礎(chǔ)上本室的劉湘麗碩士對AIF分子進(jìn)行進(jìn)一步截短成功構(gòu)建了四種截短型AIF基因即: AIFΔ1-300(301-613aa)、AIFΔ1-352(353-613aa)、AIFΔ1-400(401-613aa)、AIFΔ1-480(481-613aa)基因,并證實(shí)這些截短型AIF分子仍具有促凋亡活性,鑒于這些截短型AIF分子仍然存在分子量過大的特點(diǎn),在實(shí)際應(yīng)用中可能存在困難,我們擬對AIF分子進(jìn)行進(jìn)一步截短,以期獲得不影響AIF分子促凋亡活性的人AIF C末端截短體分子。本研究在前期獲得的截短型AIFΔ1-480的基礎(chǔ)上用PCR方法構(gòu)建了人AIF C末端截短體分子AIFΔ1-500(501-613aa)和AIFΔ1-530(531-613aa),將其作為實(shí)驗組基因;同時構(gòu)建了陰性對照基因AIF360-480,將人AIF C末端截短體基因及陰性對照基因克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3中,經(jīng)DNA測序,證實(shí)獲得序列正確。將帶有成熟型AIF基因的質(zhì)粒、AIF C末端截短體基因的質(zhì)粒及陰性對照質(zhì)粒分別瞬時轉(zhuǎn)染人宮頸癌HeLa細(xì)胞,通過間接免疫熒光證實(shí)C末端截短體分子在細(xì)胞中的表達(dá)。利用熒光顯微鏡可觀察到,人AIF C末端截短體分子表達(dá)于細(xì)胞漿中,與陰性對照組相比,實(shí)驗組AIF分子的表達(dá)引起HeLa細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞膜出泡,細(xì)胞核不均一等凋亡形態(tài)學(xué)變化。 由于人AIF C末端截短體分子的分子量較小,用Western blot不易檢測到,所以我們將人AIF C末端截短體分子基因與陰性對照基因均克隆入帶有Flag標(biāo)簽的真核表達(dá)載體pFlag-CMV4中,瞬時轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞,Western blot檢測其表達(dá),用激光共聚焦檢測其細(xì)胞定位,證實(shí)這些C末端截短體分子定位于細(xì)胞漿中。將人AIF C末端截短體分子瞬時轉(zhuǎn)染人宮頸癌HeLa細(xì)胞,用間接免疫熒光、MTT法、Annexin V分析證實(shí)了實(shí)驗組AIF分子可誘導(dǎo)Cytc的釋放并可抑制HeLa細(xì)胞的增殖。 綜上所述,人AIF C末端截短體分子AIFΔ1-500及AIFΔ1-530均具有促凋亡活性。與成熟AIF分子相比,我們構(gòu)建的AIF分子更小,更有利于進(jìn)行腫瘤臨床治療研究,本研究為將人AIF C末端截短體分子應(yīng)用于腫瘤治療奠定了理論基礎(chǔ)。
【圖文】：

AIF的三維晶體結(jié)構(gòu)

圖 2 AIF 的雙功能模型胞內(nèi)AIF在線粒體中所催化的還原反應(yīng)尚不清楚。特性說明，AIF可作為一種電子傳遞酶類發(fā)揮作用化還原酶的相似性，可以推測AIF可能與Cyt bc1復(fù)
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R346

【參考文獻(xiàn)】

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1 張文霞,王立新,孫慧,郝學(xué)謙,李莉,王志光;電脈沖與惡性淋巴瘤細(xì)胞p53和bcl-2基因表達(dá)[J];中國病理生理雜志;2003年02期

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本文編號：2577158