【摘要】： 宮頸癌和宮頸癌前病變是全世界婦女健康的一個(gè)主要問(wèn)題。臨床學(xué)，分子生物學(xué)，和流行病學(xué)調(diào)查已經(jīng)證明人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是宮頸癌和宮頸非典型增生的主要病因。99％的宮頸癌患者被檢測(cè)含有高危型HPVs，最常見(jiàn)的類(lèi)型有16，18，31，和45。每年，全世界約有470，000例宮頸癌患者被診斷出來(lái)，有一半的婦女將痛苦地死亡。在美國(guó)，每年要進(jìn)行5千萬(wàn)例巴氏試驗(yàn)，他們發(fā)現(xiàn)約有1.2百萬(wàn)例低度宮頸非典型增生(Cervical intraepithelial neoplasia[CIN]1)，300，000例高度宮頸非典型增生(CIN2／3)和10，000例宮頸癌。在美國(guó)，每年用于宮頸癌的篩選和治療的醫(yī)療費(fèi)估計(jì)在60億美元。雖然在發(fā)達(dá)國(guó)家通過(guò)巴氏試驗(yàn)大幅度降低了這種疾病的發(fā)病率，在美國(guó)2005年仍然有3，710人死于宮頸癌。在世界其它地方，大多數(shù)婦女不能進(jìn)行常規(guī)婦科檢測(cè)和篩選，宮頸癌在女性腫瘤死亡率中居第2位，繼乳腺癌之后。 現(xiàn)在治療宮頸非典型增生僅限于切除或燒蝕方法來(lái)移除或破壞宮頸組織。這樣治療的有效率大約達(dá)到90％，但可能復(fù)發(fā)和帶來(lái)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。外科治療只是切除宮頸非典型增生組織，那些似乎正常的感染HPV的組織而未處理。因此根除這種感染最理想的方法是用疫苗，就像乙肝預(yù)防乙型肝炎一樣，在青少年沒(méi)有遇到HPV之前就注射預(yù)防性疫苗。對(duì)于那些已經(jīng)感染的婦女和遭受早期宮頸癌的患者可以用正在研究中的治療性疫苗。Merck公司用釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)研制的HPV6，11，16，，18型四價(jià)疫苗，商品名Gardasil(嘉德西哥)于2006年6月8日被美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市。葛蘭素史克(GSK)公司采用桿狀病毒昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)研制的HPV16／18型兩價(jià)疫苗也已接近完成Ⅲ期臨床研究，可能在2007年10月獲得批準(zhǔn)上市。 本研究主要是從Genebank中查出所有的較全18L1基因序列，并按照畢赤酵母密碼子偏愛(ài)性原則，優(yōu)化設(shè)計(jì)出HPV18L1基因(1725bp)并合成全長(zhǎng)序列，然后利用畢赤酵母表達(dá)載體pAO819~r表達(dá)載體，在體外構(gòu)建含一個(gè)和二個(gè)拷貝的L1基因載體pAO819r-L1和pAO819r-L1Ⅱ。線形化后轉(zhuǎn)化到Gs115酵母細(xì)胞，經(jīng)G418抗性篩選獲高拷貝工程菌并用甲醇誘導(dǎo)表達(dá)。構(gòu)建了DNA疫苗載體pDRVI1.0-18L1，大提質(zhì)粒后免疫BalB／C小鼠制備抗體，為研制HPV18型診斷試劑和抗原鑒定提供科學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 表達(dá)產(chǎn)物采用化學(xué)發(fā)光Western blot鑒定，用自制抗HPV18 L1蛋白鼠血清作為一抗，在55KDa處有誘導(dǎo)蛋白免疫印跡出現(xiàn)。證明該表達(dá)系統(tǒng)能表達(dá)出HPV18L1蛋白。細(xì)胞破碎后經(jīng)過(guò)超速梯度離心的純化方法，得到的樣品在電鏡下觀察到HPV18的病毒樣顆粒。篩選出畢赤酵母高表達(dá)株后，進(jìn)行了5L發(fā)酵罐的發(fā)酵工藝，菌體破碎工藝和純化工藝摸索。實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建的畢赤酵母表達(dá)菌株，可經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)HPV18L1晚期蛋白，表達(dá)的L1能在細(xì)胞內(nèi)自主組裝成病毒樣顆粒，而且能在廉價(jià)的培養(yǎng)基上快速生長(zhǎng)到高細(xì)胞密度，有利于在工業(yè)上進(jìn)行高密度發(fā)酵。本研究為HPV18基因工程疫苗的后續(xù)研發(fā)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖2.乳頭瘤病毒在鱗狀上皮細(xì)胞的生活周期.宮頸分層鱗狀上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)HPv蛋白表達(dá)，上皮干細(xì)胞的子細(xì)胞沿著基底層分化，在HPV感染基底層上皮細(xì)胞的始表達(dá)病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白，在這些蛋白的調(diào)節(jié)下，分裂的細(xì)胞數(shù)指數(shù)增長(zhǎng)，上皮細(xì)胞少能完成，病毒蛋白隨著分化而連續(xù)表達(dá)，成熟的病毒只在上皮細(xì)胞的最外層產(chǎn)生，抗原呈(APCs)在HPV感染的上皮組織中衰竭。HPv基因組編碼8種蛋白(8個(gè)閱讀框)，Ll和L2晚期基因編碼病毒外殼蛋期蛋白E1和E2負(fù)責(zé)病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，E4作用似乎是幫助病毒從感染細(xì)胞f6J。高危型HPv的早期基因E6和E7編碼主要的轉(zhuǎn)化蛋白，這些蛋白能使上皮生化，啟動(dòng)細(xì)胞癌變過(guò)程(如圖3)。曲娜J1l幻‘，筍，.1.補(bǔ)、鑿!!哪。，心峋!J奮匕百卜血‘，‘翻燦腸r，，，O、}\a_.上毒個(gè)﨑。呱!噩副

這些早期基因編碼的蛋白干擾了抑癌基因的正常功能:E6蛋白能和p用，導(dǎo)致p53失去功能，從而使p53阻止細(xì)胞分裂的功能受損，E6也能使端超過(guò)它的臨界點(diǎn)，使細(xì)胞不能正常進(jìn)行程序性死亡;E7能與視網(wǎng)膜母細(xì)胞(pRb)結(jié)合，激活那些使細(xì)胞周期開(kāi)始的基因，導(dǎo)致組織增殖;E5也與細(xì)有關(guān)。因此，現(xiàn)在己有分子生物學(xué)數(shù)據(jù)說(shuō)明HPV致癌癥機(jī)理。臨床學(xué)，病理毒學(xué)研究已經(jīng)確定了宮頸癌發(fā)展過(guò)程。宮頸癌的致病機(jī)理是在性活動(dòng)過(guò)程皮組織細(xì)胞被HPV感染，病毒持續(xù)復(fù)制和脫落導(dǎo)致宮頸上皮組織細(xì)胞發(fā)生變上稱(chēng)為CINI。接著病毒基因組從游離形式轉(zhuǎn)變成整合形式，E6和E7基因蛋白EZ在這個(gè)過(guò)程中缺失或失活，疾病就發(fā)展成高度宮頸損傷(CINZ/3)和侵襲癌的發(fā)生關(guān)鍵點(diǎn)是E6和E7所介導(dǎo)染色體的保護(hù)者p53和pRb失活，組不穩(wěn)定，抑制細(xì)胞程序性死亡。許多研究表明病毒的中和抗體能間接地免遭實(shí)驗(yàn)性乳頭瘤病毒感染，例如將病毒樣顆粒(VLPs)接種產(chǎn)生的兔子血nalve兔子，就能起到保護(hù)作用[8]。相似，如果接種的是L2，就能保護(hù)兔子毒引起的乳頭瘤，但不能御防病毒DNA，這與中和抗體介導(dǎo)的保護(hù)機(jī)理相關(guān)〔Cyt。沁g丫
【學(xué)位授予單位】：華中師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類(lèi)號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2576445