【摘要】： 隨著人類基因組測序工作的完成,對基因表達產(chǎn)物蛋白質(zhì)的研究已成熱點。為揭示眾多蛋白質(zhì)的作用和相互關(guān)系,從而真正破解基因功能,以蛋白質(zhì)組學(xué)為核心的后基因組研究已成為必然趨勢。蛋白芯片(protein chip)是按預(yù)先設(shè)計的方式將抗原或抗體固定在玻片上,形成蛋白質(zhì)的微陣列,即蛋白質(zhì)芯片,帶有特殊標(biāo)記的蛋白質(zhì)分子(抗體或抗原)與之特異性結(jié)合,通過對標(biāo)記物的檢測來實現(xiàn)抗原抗體的高通量互檢。該技術(shù)所需蛋白質(zhì)的量極少,檢測反應(yīng)相對較快,具有通量化,穩(wěn)定性較好,靈敏度較高。目前在國內(nèi)外這方面的研究都才剛剛起步。蛋白質(zhì)芯片以蛋白質(zhì)代替DNA作為檢測目的物,比基因芯片更接近生命活動的物質(zhì)層面,因而有著比基因芯片更加直接的應(yīng)用前景。同時由于蛋白質(zhì)芯片可利用微量生理或生物采樣即可同時檢測不同的蛋白質(zhì)分子和蛋白質(zhì)分子之間的相互作用,獲得各種條件下蛋白質(zhì)組的變化.進而得以對基因的表達情況及基因功能進行深入研究。高通量定量檢測的蛋白質(zhì)芯片是臨床檢測和實驗研究不可缺少工具,本研究為研制玻片為載體的高通量蛋白質(zhì)芯片,以人血清IgG為研究模型,建立定量檢測蛋白質(zhì)芯片技術(shù)平臺,并應(yīng)用于人血清IgG的檢測,其檢測結(jié)果與傳統(tǒng)的ELISA方法比較。 研究內(nèi)容分兩個部分,1.介質(zhì)表面修飾對蛋白質(zhì)芯片固定率和反應(yīng)性的影響。2.定量檢測人血清IgG蛋白質(zhì)芯片研制及應(yīng)用研究。 第一部分:對最常用的三種玻璃表面化學(xué)修飾方法對蛋白質(zhì)芯片質(zhì)量的影響進行評價。為研制評價蛋白質(zhì)固定效率的芯片,用Cy3標(biāo)記的山羊抗人IgG抗體樣品,用含40%甘油的PBS溶液稀釋成為0.5 mg/L,0.75 mg/L,1 mgm,1.25 mg/L,1.5 mg%qL,1.75 mg%qL,2.0 mg%qL等濃度。取戊二醛、poly-L-lysine,GTPS環(huán)氧基修飾的玻片各一塊,按上述濃度點樣,每一濃度點1列3點,形成3×7的陣列,點樣過程的溫度為室溫(25℃),濕度為30%～40%。點樣完成后,將玻片放入濕盒中進行溫浴4h,晾干,用Genepix4000B掃描儀獲取熒光圖象。取出玻片,用PBST(PBS中含0.1%Tween-20)清洗3遍,每次5 min,再用PBS清洗5 min,晾干,再用Genepix4000B掃描儀獲取熒光圖象。 為研制評價蛋白質(zhì)反應(yīng)性的芯片,用倍比稀釋法,連續(xù)人血清lgG樣品分別至3.125mg%qL,6.25mg/L,12.5mg/L,25mg%qL,50mg/L,100mg%qL等濃度,在戊二醛、poly-L-lysine修飾的玻片點樣,每一濃度點1列3點,形成3×7的陣列,點樣過程的溫度為室溫(25℃),濕度為30%～40%。點樣完成后,將玻片放入濕盒中進行:37℃溫浴4h,晾干,用1%BSA(質(zhì)量體積比)作封閉,將玻片放入封閉液反應(yīng)1h,降低非特異性吸附,用PBST(PBS中含0.1%Tween-20)清洗3遍,每次5min,再用PBS清洗5 min,將戊二醛修飾的破片用0.2%的硼氰化鈉還原Schiff堿形成更穩(wěn)定的單鍵結(jié)構(gòu)。取Cy3 goat-anti-human IgG(0.5 mg%qL)1.6μl到芯片陣列的表面,用蓋玻片壓勻,放入濕盒中進行37℃溫浴1h,取出用PBST(PBS中含0.1%Tweon-20)清洗3遍,每次5 min,再用PBS清洗5 min,晾干,掃描儀獲取熒光圖象。三種修飾方法的芯片均可使蛋白質(zhì)保持較好的固定效率和反應(yīng)活性,由共價鍵偶聯(lián)的戊二醛修飾玻片不僅有更高的反應(yīng)活性,而且圖象佳,但背景略高。預(yù)點樣10個拷貝點后,各蛋白質(zhì)樣品的熒光測量值趨于穩(wěn)定,可正式點樣。點樣后的固定時間以24-48h為宜。時間過長或過短均會導(dǎo)致熒光測量值偏低。使用1%BSA封閉緩沖液的封閉效果最好。最佳的抗原一抗體特異性結(jié)合反應(yīng)溫度為37 0C、時間為2h,選擇1mg/ml作為最佳的點樣濃度。綜合評價,戊二醛修飾的蛋白質(zhì)芯片優(yōu)于多聚賴氨酸修飾芯片,醛基修飾的蛋白質(zhì)芯片用于科研和臨床蛋白質(zhì)檢測是可行的,這為蛋白質(zhì)芯片的應(yīng)用開發(fā)提供選擇的依據(jù)但應(yīng)當(dāng)探討如何降低醛基修飾芯片的背景這對于提高蛋白質(zhì)芯片的敏感性和信噪比,具有重要意義,此方面技術(shù)有待進一步探索。 第二部分:建立定量檢測人血清IgG蛋白質(zhì)芯片的技術(shù)平臺。為研制定量檢測人血清IgG蛋白質(zhì)芯片,選擇醛基修飾的城片為載體,蛋白質(zhì)樣品溶解于20%甘油的PBS,由機械手將濃度為0.5 mg/ml人IgG單克隆抗體點樣在玻片上,人血清白蛋白為陰性對照,以1%的BSA為封閉液對蛋白質(zhì)芯片進行封閉,并經(jīng)相應(yīng)處理,構(gòu)建用于定量檢測人血清lgG蛋白質(zhì)芯片。以IgG標(biāo)準(zhǔn)品為檢測對象,建立蛋白質(zhì)芯片方法和ELISA方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線,分別用蛋白質(zhì)芯片方法和ELISA方法檢測10例人血清IgG。將純化的羊抗人IgG 0.5mg/ml 30%甘油/PBS,點樣在經(jīng)硝酸纖維素修飾的片基上,以人血清白蛋白為陰性對照,用1%BSA封閉,制備定量檢測人血清IgG的蛋白質(zhì)芯片;同時用ELISA檢測人血清IgG。SPSS 10.0軟件分析蛋白質(zhì)芯片和ELISA的試驗結(jié)果,采用單因素方差分析兩組間相關(guān)性。結(jié)果顯示蛋白質(zhì)芯片和ELISA校準(zhǔn)曲線的R~2值分別是0.996和0.994。兩種方法檢測的10例人血清IgG含量,其檢測限均在1.56μg%q100μL。用單因素方差分析結(jié)果顯示f=0.188,P=0.670＞0.05,表明兩組間差異無顯著性意義,具有很好的一致性。本研究以人血清IgG為模型,比較蛋白質(zhì)芯片與ELISA在定量分析中的效果,顯示出二者的高度相關(guān)性。抗體芯片的基礎(chǔ)在于包被于芯片基質(zhì)上的抗體的有效數(shù)量和活性,作為蛋白質(zhì)芯片技術(shù)中最具應(yīng)用前景的抗體芯片技術(shù),在定量分析中有一定的優(yōu)勢。
【圖文】：

， )))35.77730.55533.0004.3333.3封閉劑的選擇由圖2中可以看出，不同封閉劑的封閉效果有一定的差異，1%BSA溶液封閉效果較好(A)，封閉的玻片背景較為干凈，而5%脫脂奶粉封閉的效果(B)要差于前者，奶粉的蛋白成分較為復(fù)雜，存在其顆粒在玻片上與熒光素結(jié)合后可產(chǎn)生異常明亮的熒光信號的現(xiàn)象。提示使用時可能產(chǎn)生非特異性反應(yīng)，干擾反應(yīng)結(jié)果。后續(xù)試驗均選用1%BSA溶液封閉芯片。

我們分別用含有45%，30%，巧%的甘油緩沖液稀釋蛋白質(zhì)樣品。在每塊玻片上，每一行重復(fù)點上4個點，每一列樣品濃度都是自上而下升高，分別是稀釋1000，500，250，100倍。由圖3可以看出(甘油含量分別為:l:45%，2:30%，3:巧%，每一組中，從上到下，Cy3一IgG的稀釋倍數(shù)分別為 1000倍，500倍，，250倍，100倍)，在戊二醛修飾的的玻片上，用含有45%甘油的緩沖液稀釋樣品時
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R392

【引證文獻】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 陳晗;生物光盤傳感器理論分析及初步實驗研究[D];國防科學(xué)技術(shù)大學(xué);2010年

本文編號：2576377