【摘要】： 目的:探索構(gòu)建能表達(dá)人B型利鈉肽(hBNP)的pLenti6/V5-hBNP載體的方法,以實(shí)現(xiàn)hBNP基因在骨骼肌成肌細(xì)胞中長久、穩(wěn)定的表達(dá)。方法:體外培養(yǎng)SD(Sprague Dawley)鼠骨骼肌成肌細(xì)胞,并通過免疫組織化學(xué)方法鑒定所得細(xì)胞、用臺酚蘭染色確定培養(yǎng)細(xì)胞的活性并繪制生長曲線。將目的基因hBNP亞克隆到真核細(xì)胞表達(dá)載體pLenti6/V5-D-TOPO載體上,構(gòu)建重組質(zhì)粒pLenti6/V5-hBNP。將pLenti6/V5-hBNP及陽性對照質(zhì)粒pLenti6/V5-EGFP分別用lipofectamin 2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞,獲得病毒顆粒;用病毒顆粒轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的SD乳鼠骨骼肌成肌細(xì)胞。熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)確定陽性對照質(zhì)粒的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染數(shù),從而估計(jì)該基因的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率。加入篩選試劑以獲得穩(wěn)定表達(dá)異源B型利鈉肽(BNP)的成肌細(xì)胞。收集瞬時(shí)轉(zhuǎn)染及篩選后的細(xì)胞培養(yǎng)基,用酶連結(jié)免疫吸附分析(ELISA)檢測試劑盒檢測hBNP的表達(dá)水平。結(jié)果:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法、雙酶切法及DNA測序顯示hBNP基因成功地插入到pLenti6/V5-D-TOPO載體中;免疫組化顯示此法培養(yǎng)成肌細(xì)胞質(zhì)的純度達(dá)到94 %,并且臺酚蘭染色細(xì)胞的存活率亦達(dá)到了94 %以上;陽性對照質(zhì)粒的病毒顆粒感染細(xì)胞12 h后,在熒光顯微鏡下觀察,其轉(zhuǎn)染效率達(dá)60%以上。檢測收集的上清,結(jié)果與陰性對照有顯著差別(P0.01),觀察至第4 w,hBNP仍持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)。結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了能在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)人B型鈉尿肽的重組質(zhì)粒pLenti6/V5-hBNP,并且取得了較高的轉(zhuǎn)染效率,因此慢病毒載體介導(dǎo)的基因治療在心血管疾病中有樂觀的應(yīng)用前景。
【圖文】：

81．2．4 重組質(zhì)粒 pLenti6/V5-hBNP 的構(gòu)建 如圖（1）將目的基因片段 pLenti6/V5-D-TOPO 載體按照 pLenti6/V5-D-TOPO 載體試劑盒的說明書，， 取

圖 （7） 成肌細(xì)胞生長曲線圖表 3 不同時(shí)間點(diǎn) rhBNP 的分泌濃度the12thhour 4thday 7thday 10thday 14thday 18thday 21stdayCconcentra-tion of the 20.37±3.94 25.19±2.49 29.53±4.68 27.25±3.86 32.83±5.38 35.17±4.27 24.35±6.43rhBNP (ng/ml)
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號】：R346

【參考文獻(xiàn)】

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1 孫自勇,朱鎮(zhèn)華,陳均勇,劉莉莉,張巍,楊慶,張菁,劉建寧;重組人腦鈉素在大腸桿菌中的表達(dá)、純化與鑒定[J];南京大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2004年01期

2 朱記法,盧永昕,李鋒,田俊,王玉;成肌細(xì)胞表達(dá)異源心鈉素基因的研究[J];中國分子心臟病學(xué)雜志;2004年05期

本文編號：2575180