發(fā)布時(shí)間：2020-01-31 11:35

【摘要】：萊克多巴胺屬于雙苯烷胺類的β-腎上腺素受體激動(dòng)劑(簡(jiǎn)稱β-激動(dòng)劑),具有廣泛的生理效應(yīng),常被用于支氣管哮喘、支氣管痙攣和產(chǎn)科疾病的治療。當(dāng)其用量為臨床用量的5-10倍時(shí),又是良好的營(yíng)養(yǎng)重分配劑和生長(zhǎng)促進(jìn)劑。其在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的殘留一旦通過食物鏈進(jìn)入人體,會(huì)對(duì)食用者的安全產(chǎn)生極大的危害,特別對(duì)心臟病、糖尿病、高血壓、甲亢、青光眼、前列腺肥大等病人或老人兒童危害更大,甚至?xí)䦟?dǎo)致死亡。目前我國(guó)禁止將β-激動(dòng)劑等藥物作為動(dòng)物促生長(zhǎng)劑使用。但長(zhǎng)期以來(lái),各種因非法使用β-激動(dòng)劑而造成的中毒事件時(shí)有發(fā)生。為了打擊非法用藥,保護(hù)消費(fèi)者的健康安全,迫切需要健全相關(guān)的檢測(cè)方法。萊克多巴胺的檢測(cè)方法與克倫特羅等其他β-激動(dòng)劑相比較滯后,目前我國(guó)還沒有萊克多巴胺的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法。因此,建立快速、靈敏、特異、有效的萊克多巴胺殘留檢測(cè)方法具有深遠(yuǎn)的理論意義和現(xiàn)實(shí)意義。 本研究合成了萊克多巴胺的人工抗原,通過免疫兔子獲得了免疫脾臟,利用雜交瘤技術(shù)制備了萊克多巴胺的兔單克隆抗體,建立了萊克多巴胺的ELISA檢測(cè)技術(shù),并初步構(gòu)建了萊克多巴胺的ELISA檢測(cè)試劑盒。其主要研究結(jié)果如下: 1.采用混合酸酐法合成了兩種萊克多巴胺的人工抗原,其中一種為萊克多巴胺-BSA作為免疫抗原,另一種為萊克多巴胺-OVA作為包被抗原。通過紫外掃描法、紅外掃描法和Agilent 2100生化分析儀芯片實(shí)驗(yàn)室試劑盒對(duì)人工抗原進(jìn)行了鑒定,證實(shí)了人工抗原合成成功,測(cè)得免疫抗原分子質(zhì)量為76.4kDa,并估算得到半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)比率為28:1。采用考馬斯亮藍(lán)法對(duì)合成抗原中蛋白質(zhì)的含量進(jìn)行測(cè)定,得到免疫抗原中蛋白質(zhì)的濃度是3.62mg/mL,包被抗原中蛋白質(zhì)的濃度是1.156mg/mL。 2.用合成的免疫抗原采用背部皮下注射、胭淋巴結(jié)注射和耳緣靜脈注射相結(jié)合的方法免疫WHB黑眼大白兔,。免疫七次后,獲得了高效價(jià)的萊克多巴胺多克隆抗血清,其中5號(hào)抗血清的效價(jià)為1:32×10~4,6號(hào)抗血清的效價(jià)為1:16×10~4。并采用飽和硫酸銨法初步純化抗血清。 3.通過免疫WHB黑眼大白兔,同時(shí)獲得了兔子的免疫脾臟,將脾細(xì)胞與處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的兔骨髓瘤細(xì)胞240E進(jìn)行細(xì)胞融合,并分裝于40塊96孔板中(助融劑為50%的PEG)。用HAT作為選擇性培養(yǎng)基對(duì)融合后的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。利用間接ELISA、間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA和IgG定量等方法篩選克隆孔,初次篩選得到116個(gè)陽(yáng)性孔。通過兩次Sub克隆后,最終篩選出A3-2-4,A3-2-6,B5-4-4和B5-4-5共四株高特異性的雜交瘤細(xì)胞,經(jīng)反復(fù)凍存及復(fù)蘇,雜交瘤細(xì)胞分泌抗體穩(wěn)定。通過體外培養(yǎng)法擴(kuò)大生產(chǎn)兔單克隆抗體。 4.對(duì)ELISA檢測(cè)條件進(jìn)行了優(yōu)化,得到的最佳反應(yīng)條件為:包被時(shí)間4℃ 12h,一抗作用時(shí)間60min,二抗作用時(shí)間100min,底物作用時(shí)間15min。因?yàn)榈孜锝M成對(duì)ELISA檢測(cè)的靈敏度有較大影響,所以試驗(yàn)還對(duì)底物配方進(jìn)行了優(yōu)化,得到TMB和H_2O_2的最佳組合為0.25g/L的TMB+0.02%的H_2O的結(jié)論。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號(hào)】：R392

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 高翔;生物素—親和素放大酶聯(lián)免疫快速檢測(cè)動(dòng)物組織中萊克多巴胺殘留[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2009年

2 沈金兒;抗GNA兔單克隆抗體的制備及其夾心ELISA檢測(cè)體系的建立[D];浙江大學(xué);2013年

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本文編號(hào)：2575024