【摘要】：萊克多巴胺屬于雙苯烷胺類的β-腎上腺素受體激動劑(簡稱β-激動劑),具有廣泛的生理效應(yīng),常被用于支氣管哮喘、支氣管痙攣和產(chǎn)科疾病的治療。當(dāng)其用量為臨床用量的5-10倍時,又是良好的營養(yǎng)重分配劑和生長促進劑。其在動物機體內(nèi)的殘留一旦通過食物鏈進入人體,會對食用者的安全產(chǎn)生極大的危害,特別對心臟病、糖尿病、高血壓、甲亢、青光眼、前列腺肥大等病人或老人兒童危害更大,甚至?xí)䦟?dǎo)致死亡。目前我國禁止將β-激動劑等藥物作為動物促生長劑使用。但長期以來,各種因非法使用β-激動劑而造成的中毒事件時有發(fā)生。為了打擊非法用藥,保護消費者的健康安全,迫切需要健全相關(guān)的檢測方法。萊克多巴胺的檢測方法與克倫特羅等其他β-激動劑相比較滯后,目前我國還沒有萊克多巴胺的國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法。因此,建立快速、靈敏、特異、有效的萊克多巴胺殘留檢測方法具有深遠的理論意義和現(xiàn)實意義。 本研究合成了萊克多巴胺的人工抗原,通過免疫兔子獲得了免疫脾臟,利用雜交瘤技術(shù)制備了萊克多巴胺的兔單克隆抗體,建立了萊克多巴胺的ELISA檢測技術(shù),并初步構(gòu)建了萊克多巴胺的ELISA檢測試劑盒。其主要研究結(jié)果如下: 1.采用混合酸酐法合成了兩種萊克多巴胺的人工抗原,其中一種為萊克多巴胺-BSA作為免疫抗原,另一種為萊克多巴胺-OVA作為包被抗原。通過紫外掃描法、紅外掃描法和Agilent 2100生化分析儀芯片實驗室試劑盒對人工抗原進行了鑒定,證實了人工抗原合成成功,測得免疫抗原分子質(zhì)量為76.4kDa,并估算得到半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)比率為28:1。采用考馬斯亮藍法對合成抗原中蛋白質(zhì)的含量進行測定,得到免疫抗原中蛋白質(zhì)的濃度是3.62mg/mL,包被抗原中蛋白質(zhì)的濃度是1.156mg/mL。 2.用合成的免疫抗原采用背部皮下注射、胭淋巴結(jié)注射和耳緣靜脈注射相結(jié)合的方法免疫WHB黑眼大白兔,。免疫七次后,獲得了高效價的萊克多巴胺多克隆抗血清,其中5號抗血清的效價為1:32×10~4,6號抗血清的效價為1:16×10~4。并采用飽和硫酸銨法初步純化抗血清。 3.通過免疫WHB黑眼大白兔,同時獲得了兔子的免疫脾臟,將脾細胞與處于對數(shù)生長期的兔骨髓瘤細胞240E進行細胞融合,并分裝于40塊96孔板中(助融劑為50%的PEG)。用HAT作為選擇性培養(yǎng)基對融合后的細胞進行培養(yǎng)。利用間接ELISA、間接競爭ELISA和IgG定量等方法篩選克隆孔,初次篩選得到116個陽性孔。通過兩次Sub克隆后,最終篩選出A3-2-4,A3-2-6,B5-4-4和B5-4-5共四株高特異性的雜交瘤細胞,經(jīng)反復(fù)凍存及復(fù)蘇,雜交瘤細胞分泌抗體穩(wěn)定。通過體外培養(yǎng)法擴大生產(chǎn)兔單克隆抗體。 4.對ELISA檢測條件進行了優(yōu)化,得到的最佳反應(yīng)條件為:包被時間4℃ 12h,一抗作用時間60min,二抗作用時間100min,底物作用時間15min。因為底物組成對ELISA檢測的靈敏度有較大影響,所以試驗還對底物配方進行了優(yōu)化,得到TMB和H_2O_2的最佳組合為0.25g/L的TMB+0.02%的H_2O的結(jié)論。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號】：R392

【引證文獻】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 高翔;生物素—親和素放大酶聯(lián)免疫快速檢測動物組織中萊克多巴胺殘留[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2009年

2 沈金兒;抗GNA兔單克隆抗體的制備及其夾心ELISA檢測體系的建立[D];浙江大學(xué);2013年

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本文編號：2575024