【摘要】： 乙型肝炎病毒(HBV)屬嗜肝DNA病毒,它是導(dǎo)致肝炎、肝硬化和肝細胞癌的主要原因。HBV感染致肝細胞損傷機制,很大程度上與病毒蛋白和肝細胞蛋白間的相互作用相關(guān)。因此,研究HBV的抗原成分與肝細胞內(nèi)的蛋白相互作用及其機制,在一定程度上能夠闡明HBV的致病機制,為尋找有效的防治HBV的方法提供理論依據(jù)。 本課題組成員應(yīng)用抑制性消減雜交(suppression subtractive hybridization,SSH)技術(shù),對于HBV前-S1蛋白反式激活作用的靶基因進行篩選,發(fā)現(xiàn)了前-S1蛋白可上調(diào)一未知功能基因的表達,命名為前-S1蛋白反式激活基因2(PS1TP2),我們將其成功克隆,并應(yīng)用生物信息學(xué)初步探討其結(jié)構(gòu)及功能。 為研究PS1TP2在HBV感染后病毒致病過程中的作用,從人肝癌細胞中得到PS1TP2基因的全長編碼序列,構(gòu)建與綠色熒光蛋白融合的表達載體pEGFP-C1-PS1TP2,通過基因與熒光蛋白基因融合表達,明確它的亞細胞定位主要在細胞漿。進一步應(yīng)用酵母雙雜交(yeast two-hybrid)技術(shù)篩選PS1TP2與白細胞文庫中的結(jié)合蛋白,包括一些與細胞免疫、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、能量代謝、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)相關(guān)的基因。將該基因克隆至原核表達載體pET32a(+)上,構(gòu)建原核表達重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta誘導(dǎo)進行融合表達。結(jié)果在大腸桿菌中獲得了高效表達的融合蛋白,表達蛋白以包涵體形式存在。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示該蛋白的分子量約為41kD,這與預(yù)測的PS1TP2融合蛋白大小相吻合,并且通過Western-blotting檢測證實了PS1TP2的表達。 我們以分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建PS1TP2的真核表達載體pcDNA3.1(-)-PS1TP2,以表達質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-PS1TP2轉(zhuǎn)染HepG2細胞,以空載體pcDNA3.1(-)為平行對照,制備轉(zhuǎn)染后的細胞裂解液。應(yīng)用抑制性消減雜交(SSH)技術(shù),構(gòu)建PS1TP2激活相關(guān)基因差異表達的cDNA消減文庫,篩選相關(guān)的靶基因片段,將產(chǎn)物與T/A載體連接,構(gòu)建cDNA消減文庫,并轉(zhuǎn)染大腸桿菌進行文庫擴增,隨機挑選克隆,多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增后進行測序及同源性分析。篩選到的cDNA全長序列,包括一些與細胞生長調(diào)節(jié)、細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、腫瘤及物質(zhì)代謝密切相關(guān)的蛋白編碼基因,推測PS1TP2在體內(nèi)可能存在的調(diào)控機制的線索。 對該基因功能進行的初步了解,為下一步更加具體的生物學(xué)功能、基因表達調(diào)控的深入研究開辟道路。
【圖文】：

1000~100~爵573bp圖1一 1PSITPZ基因的RT-PCR擴增結(jié)果(2)PSITPZ基因的生物信息學(xué)分析 l)PSITPZ基因在染色體上的定位將基因測序結(jié)果與NCBI進行BLASTh比對分析，Psl仰2基因位于人染色體6q24.l(圖l一2)。[‘.50117‘卜[一7352，.幾卜卜一--一一口一，一--~--月””.R玲Gp.1鴿.......中日xv〔pZ，，，Loc。略5557-C6o卜卞55只~一十圖l一 2chromosome:6;Loeation:6q24.l2)PSITPZ基因啟動子活性預(yù)測及其5’一端CpG島的分析對PSITPZ基因序列進行Blastn分析，找到其前端 5000bp序列(即6q24.l的80721一85720)，分析CpG島發(fā)現(xiàn):

圖1.5X代表低復(fù)雜性區(qū)域氨基酸序列進行PHD方法預(yù)測包含提交蛋白質(zhì)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。Pl刃0htm表示預(yù)測的跨膜螺旋空格表示非跨膜螺旋區(qū))，Relhtm表示Pl田Dhtm預(yù)測的可靠越大)，SUBhtm表示預(yù)測的跨膜螺旋結(jié)構(gòu)的集合(所有區(qū)域代表非跨膜螺旋區(qū)，.代表可靠性<7)，PHD血m表示PHDht表示Pl，ID預(yù)測的膜的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(T表示跨膜螺旋區(qū)，i表示膜l一6)。!、】\】\1、1、L、1\】\l、、】“、!、l8899臾拍側(cè)書夕堯冷望灼卯88、!飛、認(rèn)1\!、1入1、【、l、!\1、!、l’\價1\1\1“1、!、1、1’、l’、1’、1、!、}\!儀卜卜{.、1‘、88888笑均9望玲999.............口口.....
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R373

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